h9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定

1/6H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定1材料与方法毒株H9N2亚型AIV、H3N8亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N1亚型AIV、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸡新城疫病毒等毒株由中国农业大学动物流感研究室保存并提供。引物的设计、合成与筛选根据H9亚型禽流感病毒的HA基因的序列，通过DNAMAN软件进行比对，找出HA基因的保守区，针对HA基因的保守区序列设计特异性引物，并在GENBANK上进行BLAST检测比对分析，用软件分析上下游引物是否匹配，将分析合格的引物送上海生工生物技术有限责任公司北京合成部合成。合成了针对HA基因的5对引物，用中国农业大学流感研究室分离保存的H9N2亚型AIV进行筛选，根据扩增效率确定引物对。确定上游引物H9F5TGTGGCAACTGAAGAAAT3；下游引物H9R5ACCAACCTCCCTCTATGA3；退火温度为5。目的片断长度为42BP。主要试剂2/6TRIZOLREAGENT由INVITROGEN公司生产；反转录试剂盒K1622，FERMENTAS；氯仿、异丙醇、乙醇等均为市售；GOLDENVIEW由北京索莱宝公司生产。亚型AIV病毒含量的测定取感染H9N2亚型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/XX的尿囊液，作10倍倍比稀释，每个稀释度接种3枚鸡胚。3孵育4H，将鸡胚于过夜，收获尿囊液，测定其血凝效价，按REEDMUENCH法计算半数感染量。病毒RNA的提取与CDNA的合成取感染H9N2亚型AIV毒株A/CK/SD/ZB/XX的鸡胚尿囊液TRIZOL法提取病毒的总RNA，将干燥的RNA用11LDEPC水溶解，立即做RTPCR的扩增或80保存备用。将UNIT121L加到含RNA的11LDEPC水中，瞬时离心，70水浴MIN后，置冰上MIN。依次加入5AMVBUFFERL，DNTPSL，RNASIN1L，MLV1L，混匀，瞬时离心，3水浴1H，70MIN，保存。反应体系和反应条件的优化对RTPCR反应体系和变性、退火、延伸温度和时间、循环次数等条件进行优化，最后确定采用总体积为L的反应体系2PCRMIXBUFFER12L；浓度为0PMOL/LHA上游引物H9F1L；HA下游本文由论文联3/6盟HTTP/收集整理引物H9R1L；CDNAL；DDH2O补足至2L。最后确定RTPCR最佳循环条件为9预变性MIN；9变性30S，5退火3S，7延伸3S，34个循环；然后7延伸10MIN。产物分析与测序用最佳反应体系及条件对毒株A/CK/SD/ZB/XX进行PCR扩增，将产物进行回收纯化，送北京华大基因科技股份有限公司测序。特异性试验用建立的RTPCR方法分别对H9N2亚型、H3N8亚型、H4N6亚型、H5N1亚型AIV及ILTV、IBV、IBDV、NDV的鸡胚尿囊液进行PCR扩增，分析该检测方法的特异性。敏感性试验对已确定病毒含量的毒株A/CK/SD/ZB/XX的尿囊液进行100、101、102、103、104等不同稀释度稀释。对不同稀释度尿囊液进行PCR扩增，分析该检测方法的敏感性。检测方法的应用取经HI常规方法鉴定的H9亚型AIV感染鸡的组织样品8份，称量，研磨，加含双抗的PBS制成1020质量分数的悬液。1000R/MIN离心10MIN，取上清接种10日龄SPF鸡胚，收集247H死亡及未死亡的鸡胚尿囊液。4/6对实验室保存的10株H9N2亚型AIV及以上8个样品分别用该方法进行PCR扩增。2结果与分析病毒含量的测定结果经测定H9N2亚型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/XX的尿囊液，病毒含量为1/100L。扩增结果H9N2亚型AIVA/CK/SD/ZB/XX的扩增结果见图1。获得了42BP的目的条带，与预期产物大小相符。测序结果将HA基因扩增片段测序结果在NCBI流感数据库中进行BLAST比对，HA基因序列与A/CHICKEN/SHANDONG/A1/2016、A/CHICKEN/ZHEJIANG/611/2016等毒株的第4个片段HA基因的同源性为99。特异性试验结果H9N2亚型AIV扩增出42BP的目的条带。而NDV、H3N8亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N1亚型AIV、ILTV、IBV、IBDV的尿囊液样品均无条带出现。结果表明，该方法对H9亚型AIV进行检测具有很强的特异性，可特异性地检出H9亚型AIV。敏感性试验结果对病毒含量为1/100L的病毒A/CK/SD/5/6ZB/XX的尿囊液进行10倍倍比稀释，分别提取RNA，用该方法检测，扩增结果见图3。在103稀释时仍然可以扩增出明显的目的条带，说明该方法对病毒尿囊液的最低检出量为1/100L，灵敏度较高，敏感性较强。检测方法的应用对10株H9N2亚型AIV和8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品用该方法进行检测，结果表明，各毒株与样品均扩增出了42BP的条带，大小与预期相符，表明所建立的RTPCR检测方法的鉴定结果与HI等常规方法相比符合率为100。3讨论H9N2亚型AIV在我国鸡群中分布广泛，并能引起人类感染，给养禽业和公共卫生造成重大影响，能对其快速准确地进行鉴定非常重要。本研究根据H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的保守区序列各设计1对引物，初步建立了针对H9N2亚型禽流感病毒的RTPCR快速诊断方法，建立的RTPCR检测方法对H3、H4、H5、H9等亚型流感病毒、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒等进行检测，只有H9N2亚型AIV出现特异性目的条带，其他亚型AIV与NDV等无任何条带，说明该方法对其他亚型AIV及NDV等无交叉反应，具有特异性；通过对H9N2亚型AIV不同稀释度6/6进行检测，证实病毒尿囊液的最低检出量为1/100L，说明该检测方