DB21T 1687-2008 生鲜肉中三聚氰胺的测定

46 备案号： 辽 宁 省 地 方 标 准 1687 2008 生鲜肉中三聚氰胺的测定 008布 2008施 辽宁省质量技术监督局 发布 1687 2008 I 前 言 本标准由辽宁省动物卫生监督管理局提出并归口。 本标准由辽宁省质量技术监督局发布。 本标准附录 本标准负责起草单位：农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心（沈阳）。 本标准起草人：王淑芬 张建勋 刘全 刘敬先 刘凯 杨希国 于家丰 王丽娜 田晓玲 曲韵坤。 本标准首次发布。 1687 2008 1 生鲜肉中三聚氰胺的测定 1 范围 本标准规定了生鲜肉中三聚氰胺残留检测的制样和酶联免疫（ 、高效液相色谱（ 、气相色谱 定方法。 本标准适用于 生鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中三聚氰胺残留检测。 本标准中的酶联免疫法为筛选方法，筛选结果为阳性的样品需要用仲裁法确证，高效液相色谱法和气相色谱 中气相色谱 联免疫法定量限为 效液相色谱法定量限为 相色谱 2 规范性引用文件 下列文件的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否 可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 6682 分析实验室用水规则和试验方法 3 制样 样的制备 从原始样品中分取出约 500g，经 绞肉机绞碎、匀质使均匀。 样的保存 下贮存。 4 酶联免疫法 理 本方法基于酶联免疫法中的竞争性测定法原理，通过样品萃取物中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体，除去未结合的三聚氰胺酶标记物后，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质，加终止液后在 450光度值与样品中的三聚氰 胺含量成反比。 剂和溶液 特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。水应符合 6682二级水的规定。 聚氰胺试剂盒（附系列标准品溶液，酶标记物，清洗液、底物，终止液，说明书）。 辛烷（ 氯甲烷（ 辛烷 +三氯甲烷混合液：准确量取 40 60混匀即得。 0%甲醇 /20取 12定容至 1000此溶液 900加入 100 器和设备 标仪（带 450光片）。 旋混合器。 1687 2008 2 冻离心机。 量加样器： 20L、 50L、 100L、 150L、 250L。 温干燥箱。 析天平：感量 荡器 肉机 浆机 定步骤 品处理 准确称量 2确到 入 100%甲醇 /20涡旋 30s，振荡 5000r/ 2三氯甲烷混合液（ 混匀， 4000r/置，取上层 150 试程序 取出欲测数量的微孔条安插在酶标板上，分别吸取 0g/L、 20g/L、 100g/L、 250g/L、 500g/试样萃取液（ 150别加入 50荡使混匀， 25左右孵育 30尽酶标板，清洗液（ 板 4次，拍干。加 100每个微孔中，振荡使混匀， 25左右孵育 30 100每个微孔中，振荡混 匀， 450 注：不同品牌的试剂盒其操作步骤可能略有差异，比如稀释倍数，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。 试剂盒使用前恢复到室温。 标准和样品做平行试验以增加准确性。 果计算 以空白溶液（浓度为 0的标准溶液）的吸光度值为 100%作为计算基准，折算出各标准溶液和试样萃取液的相对吸光度值。 相对吸光度值（ %） = 绘制标准相对吸光度值与浓度（ g/L） 关系曲线，校正曲线在 20g/范围内为线性。试样萃取液的浓度（ g/L） 可以从校正曲线上读出。 5 高效液相色谱法 理 试料中的三聚氰胺经三氯乙酸和乙酸铅提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性杂质，混合型阳离子交换固相萃取小柱净化，高效液相色谱仪测定，外标法定量。 剂和材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。除色谱用水应符合 6682一级水的规定外，水应符合 6682二级水的规定。 聚氰胺对照品：含三聚氰胺（ 不得少于 氯甲烷（ 。 腈 (色谱纯。 醇（ :色谱纯。 烷磺酸钠（ 檬酸（ 2O）。 100空白吸光度值 萃取液吸光度值）标准吸光度值（或试样 （ 1） 1687 2008 3 水（ 2O）。 气 (普通氮气。 三氯乙酸溶液：准确称取三氯乙酸 20g 于 1000量瓶中，用水溶解后定容至刻度。 乙酸铅溶液：准确称取乙酸铅 22000水溶解后定容至刻度。 0%甲醇溶液：准确量取 20 100水定容至刻度。 %氨化甲醇溶液：准确量取 5 100甲醇（ 容至刻度，现用现制。 子对缓 冲溶液：称取 1000水稀释至刻度，摇匀。 聚氰胺标准储备液：精确称取约 50精确到 50 20%甲醇溶液（ 解并定容至刻度，配制成浓度为 1mg/标准储备液，于 4避光保存。 聚氰胺标准中间液：用移液管准确吸取 准贮备液（ 50 20%甲醇溶液（ 容至刻度，配成浓度为 100 g/ 聚氰胺标准工作液：分别准确吸取 100 20%甲醇溶液（ 容至刻度，配制浓度为 g/ 器和设备 效液相色谱仪（配紫外检测器）。 谱柱： 析天平：感量 平：感量 织匀浆机。 浆杯： 30 心机 心管： 50 合型阳离子 交换固相萃取柱： 60 相萃取装置。 气吹干仪。 旋混合器。 荡器。 孔滤膜： m。 定 取 取（ 2 置 50次加入 10 2 3涡旋 30速振荡提取 1010000r/上清液备用。 化 依次用 3 3取备用上清液（ 部过柱，再依次用 33洗，抽干。用 5脱，收集洗脱液置试管中。于 60下用氮气吹干，加入 试管中，涡旋 10s，用微孔滤膜（ 滤，滤液供高效液相色谱仪分析。 定 1687 2008 4 谱条件 色谱柱： 度 5 m， 25 流动相： 900 100摇匀。 检测波长： 240 柱温： 30。 流速： 进样体积： 20 L。 定 取试样溶液和相应的标准工作液，作单点或多点校准，外标法定量。标准工作液及试样液中三聚氰胺的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。 白试验 除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 果计算与表述 试料中三聚氰胺的残留量按式（ 2）计算： X=1000000s （ 2） 式中： X 试料中三聚氰胺的含量 ,单位为毫克每千克（ mg/ C 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（ g/ A 试样溶液中三聚氰胺的峰面积； 标准溶液中三聚氰胺的峰面积； M 供试试样质量，单位为克（ g）。 V 试样溶液最终定容体积，单位为毫升（ 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 法灵敏度、准确度、精密度 敏度 三聚氰胺在猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的定量限为 确度 本方法在 0% 110%。 密度 本方法的批内变异系数 15%，批间变异系数 20%。 标准溶液色谱图、猪肉样品空白色谱图、猪肉样品回收色谱图见附录 6 气相色谱 理 试料中残留的三聚氰胺经三氯乙酸和乙酸铅提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性杂质，经混合型阳离子交换固相萃取小柱净化，双三甲基三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷衍生，气相色谱 m/ 剂和材料 除特殊注明外，本标准所用试剂 均为分析纯。水应符合 6682二级水的规定。 聚氰胺对照品：含三聚氰胺（ 不得少于 氯甲烷（ 。 腈 (色谱纯。 醇（ :色谱纯。 1687 2008 5 烷磺酸钠（ 檬酸（ 2O）。 水（ 2O）。 气 (普通氮气。 啶 (优级纯。 三甲基硅基三氟乙酰胺（ +三甲基氯硅烷 (99:1。 三氯乙酸溶液：准确称取三氯乙酸 20000用水溶解后定容至刻度。 乙酸铅溶液：准确称取乙酸铅 22000水溶解后定容至刻度。 0%甲醇溶液：准确量取 20 100水定容至刻度。 %氨化甲醇溶液：准确量取 5 100甲醇（ 容至刻度，现用现制。 取 1000水稀释至刻度，摇匀。 聚氰胺标准贮备液：精确称取约 50精确到 用 20%甲醇溶液（ 解并定容至刻度，配制成浓度为 1mg/ 4避光保存。 聚氰胺标准中间液：吸取 50 20%甲醇溶液（ 释、定容，配成浓度为 100 g/标准中间液。 聚氰胺标准工作液：吸取 100用甲醇 （ 释、定容至浓度为 g/ 器和设备 相色谱 细管柱： 细管柱 。 析天平：感量 平：感量 织匀浆机。 浆杯： 30 心机。 心管： 50 合型阳离子交换固相萃取柱： 60 相萃取装置。 气吹干仪。 旋混合器。 荡器。 孔滤膜：孔径 m，有机相。 定 取 取（ 2 置 50次加入 10 2 3涡旋 30速振荡提取 1010000r/上清液备用。 化 依次用 3 3取备用上清液（ 部过柱，再依次用 33洗，抽干。用 5脱。 生化 1687 2008 6 将洗脱液（或根据洗脱液中三聚氰胺的浓度用甲醇适当稀释）在 60下用氮气吹干，加入 300 00 涡旋混匀，密封玻璃塞， 70在恒温干燥箱中反应 30却后用微孔滤膜（ 滤，滤 液用气相色谱 准曲线的制备 分别准确吸取 g/ 因试样溶液最终定容体积为 对应浓度对应分别是 g/g/g/g/g/相色谱 一个浓度重复测定 2次，测得的峰面积平均值与对应浓度绘制标准曲线，拟合，求得回归方程和相关系数。 定 相色谱 色谱柱： 或相当者 。 载气：氦气，流速为 进样量： 1 L。 进样口温度： 260。 升温程序：起始温度 75，持续 30 /00，保持 传输线温度： 280。 运行时间： 扫描范围： 60m/z。 扫描模式： 选择离子监测（ 。监测离子 m/171、 327、 342，定量离子 m/ 离子源： 离子源温度： 230。 70 定 定性方法：衍生后试样溶液峰与三聚氰胺标准品峰保留时间的 相对偏差不大于 且四个监测离子丰度比与标准溶液的四个监测离子丰度比一致（即相差在 20%以内），可判断试样中含有三聚氰胺。 定量方法：取 衍生后的标准工作液及试样溶液，以 m/峰）面积积分值 进行单点或多点校准 。 白试验 除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 果计算与表述 试料中三聚氰胺的残留量按式（ 3）计算： X=1000000s （ 3） 式中： X 试料中三聚氰胺的残留量 ,单位为毫克每千克（ mg/ C 标准工作液中三聚氰胺的上机浓度，单位为微克每毫升（ g/ A 试样溶液中经衍生化三聚氰胺 327碎片离子的峰面积； 标准工作液中经衍生化三聚氰胺 327碎片离子的峰面积； M 供试试样质量，单位为克（ g）； V 试样溶液最终定容体积，单位为毫升（ P 稀释倍数。 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均 值表示，保留三位有效数字。 法灵敏度、准确度、精密度 敏度 1687 2008 7 三聚氰