中文温度、湿度和剪口龄期对腐烂病菌和轮纹病菌自剪锯口侵染和发病的影响-副本

温度、湿度和剪口龄期对腐烂病菌和轮纹病菌自剪锯口侵染和发病的影响摘要剪锯口是腐烂病和轮纹病侵染的重要途径，为了明确温度、湿度和剪口龄期对腐烂病菌和轮纹病菌自剪锯口侵染和发病的影响，本研究采用离体接种的方法研究露温、露时及温度对腐烂病菌和轮纹病菌自剪锯口侵染的影响。结果表明，露温、露时对腐烂病菌自剪口侵染木质部的影响无显著差异。温度对腐烂病菌和轮纹病菌自剪口侵染木质部的影响不明显，但影响腐烂病菌在木质部内生长扩展的深度。对离体接种的富士苹果枝条，置于不同温度下培养7天后经组织分离后发现，其中在25下腐烂病菌的分离率最高，为5787，35下腐烂病菌在木质部内的侵染深度最浅，仅为35CM。用腐烂病菌分生孢子接种的剪口，当年没有发病，次年开始发病，其中3、4、5月接种剪口的发病率最高，5月份以后接种的发病率明显降低。腐烂病菌和轮纹病菌的分生孢子随雨水传播到新鲜剪锯口处，即可引起剪口的侵染，因此保护剪锯口不被侵染，可有效防止腐烂病菌和轮纹病菌的侵染。关键词苹果腐烂病菌；苹果轮纹病菌；剪口龄期；剪锯口侵染前言苹果树腐烂病和轮纹病是中国苹果树上的两种重要枝干病害。腐烂病主要危害主干、主枝，导致皮层腐烂，造成死枝、死树，重者毁园，在中国是苹果树上的第一大病害，严重威胁苹果产业的发展。2008年调查，中国10个苹果主产省市的147个果园内，苹果树的总体发病率为527曹克强ETAL,2009。腐烂病在中国已出现四次大的流行，几乎毁灭了自50年代以来新建的苹果园。轮纹病主要危害幼树、侧枝，在枝干上形成疣状突起，称为病瘤，大量病瘤聚集在一起形成粗皮，病瘤和粗皮严重削弱树势。当枝条受水份胁迫或极度衰弱时，轮纹病菌在皮层内迅速扩展，导致皮层坏死，形成干腐症状，导致幼树和枝条枯死。2008年调查，中国7个苹果主产省市的88个果园内，枝干轮纹病的总体发病率为776，其中山东、河南和北京的危害相对较重，病株率几乎为100国立耘ETAL,2009。由于果实轮纹病和干腐病是由同一病原菌引起的FENNEREA,1925，因此除危害枝干外，轮纹病菌在枝干上还能产生大量孢子，随雨水传播侵染果实，形成轮纹症状，造成果实腐烂TANGWETAL2012。在非套袋的果实上，果实轮纹病的发病率达530，病重年份达80。苹果树腐烂病于1887年首先在日本的北海道发生，后陆续传入日本本岛和朝鲜。1916随苹果引种引入中国，19世纪20年代辽宁熊岳一带受害较重（SAKUMA1990UHMANDSOHN1995。目前主要分布于东亚地区，中国各苹果产区均有发生，其中北部省区受害严重。中国苹果树腐烂病菌由三个种组成，即VMALI，VMALICOLAZURB和VPERSOONII（LEUCOSTOMPERSOONII）。VMALI有VMALIVARMALIVMM和VMALIVARPYRIVMP两个亚种，其中VMM是导致中国苹果腐烂病的主要致病菌臧睿,2012,WANGETAL,2011。苹果树腐烂病菌属于弱寄生真菌，主要从剪锯口、冻伤、日灼伤等伤口侵染WILLISON1936BIGGS1989KEPLEYANDJACOBI2000ADAMSETAL2006；陈策ETAL,1981，也可通过芽眼、叶痕、果痕等处的微伤口侵染，剪锯口是最易受腐烂病菌侵染的部位高桑亮等，1972，也是腐烂病菌的主要侵染孔口。2011年王彩霞等王彩霞ETAL,2012检查了967块新病疤，其中源自剪锯口侵染的病疤占8004。从剪锯口侵染的腐烂病菌，主要潜伏于木质部的导管内和附着于伤口表面藤田等，1981；藤田等，1985，并不能立即致病，当病菌在木质部导管内生长扩展到达皮层时，才能导致皮层发病。木质部内腐烂病菌至少能存活35年牟惠芳，刘开启,1994；王金友ETAL,1985，条件适宜时，木质部内菌丝迅速扩展，导致皮层发病。剪锯口发病、旧病斑复发都是木质部内的菌丝生长扩展所致陈延熙,1951,王金友ETAL,1985。由于所有的苹果品种对于腐烂病菌均没有有效的抗性BESSHOETAL1994LIUETAL2011，且一旦腐烂病菌侵入到寄主组织的韧皮部深至木质部时，传统的杀菌剂已很难起到有效的防治效果TAMURAANDSAITO1982，因此一般的化学方法对于治疗腐烂病菌没有得到较好的防效ABEETAL2011。轮纹病主要从枝条的皮孔和气孔侵染，便更容易从剪锯口侵染。在剪锯口上，轮纹病菌主要侵染皮层，导致剪锯口下方皮层坏死，形成宽度2MM20MM的干腐病斑。枝条剪锯口处的干腐病斑对树体的生长影响不大，但能产生大量孢子，在生长季节随雨水传播侵染下部枝条。经23的积累，导致下部枝干严重发病。枝干病斑内的腐烂病菌和轮纹病菌都能不断产生分生孢子和子囊孢子，随降雨释放，并随雨水或气流传播到达感病部位。病菌侵入寄主组织木质部后，刮除病斑已不能防止腐烂病的发生，病菌难以铲除（佐久间勉，1983）。实验表明，轮纹病菌在枝干上侵染10天后，内吸治疗剂的防治效果最高能达到55，无法有效控制病害的发生与流行张高雷ETAL,2010。对于苹果树枝干病害的防治，上世纪50年代曾尝试适期喷药保护的措施防治枝干病害，但由于对枝干病害发生和流行规律的认识不足，以及杀菌剂保护效果差等方面的原因，未能获得预期的防治效果。60年代研究发现，腐烂病具有潜伏侵染的特性，枝干病害的防治从喷药保护为主转向喷药铲除树体内潜伏的病菌为主，并筛选出福美砷等强渗透性的杀菌剂。通过在树体休眠期喷施或涂布强渗透性的铲除剂，树体表面和浅层潜伏病原菌，以达到防治病害的目的，然而，该项技术实施10年后，仍没有达到有效控制腐烂病的目的。近年来，随着对腐烂病和轮纹病发病与流行规律认识的深入，以及新型高效杀菌剂的出现，作者认为防治枝干病害需要从幼树期开始，以保护剪锯口和枝干不受病菌侵染为基本措施，并及时刮治病斑，铲除菌源，以防止内的侵染菌原量积累为基础。剪锯口是腐烂病菌和轮纹病菌的重要侵染孔口，从苗期和幼树期开始，保护好剪锯口，有效控制腐烂病菌和轮纹病菌从剪锯口侵染，就能有效控制枝干病害的发生与流行。本研究拟在人工控制条件下的接种试验，研究明确1）腐烂病菌和轮纹病菌从剪锯口侵染所需要的温度和湿度条件；2）温度对腐烂病菌在木质部内生长扩展的影响；3）剪锯口的龄期对病菌侵染的影响；为两种枝干病害的流行预测和制订防治技术提供依据和数据。1材料和方法MATERIALSANDMETHODS11病原菌及孢子繁殖PATHOGENANDSPOREPROPAGATION2009年8月自陕西省白水县雷牙乡采集苹果树腐烂病病枝，切取病健交界处的病组织转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中，分离获得腐烂病菌VALSAMALI。用直径08MM的毛细管，自菌落边缘打取菌丝的端部转入PDA中，获得单菌丝分离菌株，编号为LXS080901。用农杆菌介导转化法ATMT将携带潮霉素B磷酸转移酶基因HPH和绿色荧光蛋白表达基因GFP转入腐烂病菌，获得转化子LXS08090116。经离体和活体测定，转化子LXS08090116和野生菌株LXS080901的生物学性状、致病性、以及在苹果枝干上形成的症状都没有差异，与田间自然发病情况一致WANGETAL,2013。2个菌株都保存于4C的冰箱中。接种前，将保存菌种从冰箱中取出，接种于PDA培养基中，25C下黑暗培养35天，取菌落边缘直径5MM新鲜菌饼，接种于大麦粒培养基（浸泡大麦粒70G,蛋白胨1G,蜂蜜水6，灭菌2H），25C恒温箱中培养15天，大麦粒上可产生大量分生孢子器。取产生分生孢子器的大麦粒，转入含有1水琼脂直径为9CM培养皿中，25C下保湿培养3天，分生孢子器中溢出大量橘黄色分生孢子角赵红ETAL,2012。挑取新鲜分生孢子角置于纯净水中，配成106个/ML孢子悬浮液用于接种枝条。本研究中室外接种全部用野生菌株LXS080901，室内离体枝条接种用转化子LXS08090116。转化子接种的材料在试验结束后全部销毁。2008年自山东莱阳市水沐头村苹果园内剪取带有典型轮纹病瘤的一年生富士枝条，切取轮纹病瘤转入PDA进行组织分离，获得组织分离的轮纹病菌（BOTRYOSPHAERIADOTHIDEA）。将组织分离菌丝转接到富士苹果幼果上，黑光灯下诱导产孢冷伟锋ETAL,2009，通过毛细管挑取单孢董娟华ETAL,2009转入PDA中培养，获得单孢分离菌株，编号为LXS030101，保存于4C的冰箱中。单孢菌株回接富士苹果果实和枝条，都能表现典型的轮纹病症状，与野生菌株的致病性无差异。接种前，将轮纹病菌从冰箱内取出，在PDA培养基上培养57天，然后打取菌饼转接到富士苹果60日龄的幼果上。接种幼果35天后发病，然后置于黑光灯（波长365NM）下诱导产孢。挑取新产生的分生孢子，用纯净水配置成104个/ML孢子悬浮液备用。12露温和露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响试验测试了7个露温和7个露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响。7个露温分别为5C、10C、15C、20C、25C、30C和35C，分别由7台恒温箱控制（BLUEPARDMGC250BP2,SHANGHAIBLUEPARDINSTRUMENTSCOLTD）。恒温箱接种前12小时开启，并设定相应温度。7个露时处理分别为接种后保湿0H、1H、3H、6H、12H、24H和48H。全部试验共49个露温与露时组合，每个组合处理3个枝条。3月份苹果萌芽前，自5年生的富士苹果树上剪取一年生的健康枝条，用消毒的枝剪，将枝条截成20CM枝段，保持剪口整齐，3个一组，插入组培瓶内，加入蒸馏水，使枝条基部浸入水中2CM，每3天更换一次蒸馏水。将水培枝条转入相应温度的恒温内预处理12小时。接种时，从恒温箱中取出枝条，用手持喷雾器，将腐烂病菌LXS08090116菌株的分生孢子悬浮液均匀喷撒到枝条的剪口上，直至剪口处有孢子悬浮液流下为止。接种后，除露时处理为0H的枝条不套塑料袋，其他露时处理的枝条，每个组合的枝条套一个塑料袋，然后放回到相应温度的恒温箱中。至处理露时结束，解除套在枝条上的塑料袋，再放回到恒温箱中继续培养。试验期间，恒温箱内的相对湿度为5080之间，解袋后，剪口表面的露水约在20分钟内蒸发。接种72小时后，将全部枝条取出，将接种端浸入75的酒精保持10秒钟，杀死剪口表面未能侵染的病菌，然后转入温度25C、相对湿度为75的人工气候箱中再培养7天。处理结束将枝条取出，用小刀剥除皮层。然后自接种端开始以1CM为单位，用消毒枝剪（每剪切一次，用75的酒精擦拭消毒20秒）从每个接种枝条上依次截取5个枝段，然后以髓部为中心按十字交叉法，将每个茎段平均分成4块枝条组织，用75的酒精浸泡30秒钟，用消毒2分钟，用75的酒精浸泡2分钟，经蒸馏无菌水漂洗3次，转接到PDA培养基中，每皿4块，在25C下培养。从第2天开始，每天检查每块分离组织内是否有菌丝长出，直到第10天结束。若分离组织内有菌丝长出，挑取菌丝在荧光显微镜下（荧光波长为）观察，若菌丝内有绿色荧光，则推断该菌丝为接种腐烂病菌的菌丝，接种病菌已生长扩展至该部分组织内。检查结束，统计每个处理同一深度12个枝段中带菌组织的块数和计算带菌百分率。全部试验在不同时间重复3次。每次重复恒温箱随机分配。13露温和露时对轮纹菌分生孢子自剪锯口侵染的影响试验测试了6个露温和5个露时对苹果轮纹病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响。6个露温处理分别为10C、15C、20C、25C、30C和35C，分别由6台恒温箱控制。5个露时处理分别为接种后保湿0H、1H、4H、12H和24H。全部试验共30个露温和露时组合，每个组合接种3个枝条。7、8月份，自5年生旺盛生长的富士苹果树上，选取40CM60CM长的当年生健康枝条，从已木质化的部位剪除梢部，形成剪锯口。让修剪枝条在树体上生长35天后，剪取长度为15CM的枝段，用于接种。接种枝条每3个一组水培，置于相应温度的恒温箱中，预处理12小时。接种时，用手持喷雾器，将轮纹病菌LXS030101菌株的分生孢子悬浮液均匀喷撒到35日龄的剪锯口，直至剪口处有孢子悬浮液流下。接种后，除露时为0小时的处理外，其他露时处理的枝条，每个枝条套一个塑料袋，放回恒温箱中。到保湿处理时间结束，解去塑料袋，让接种枝条在恒温箱中自然晾干。接种后72小时，将全部接种枝条取出，接种端在75的酒精中浸泡10秒，以杀死表面未能侵染的病菌，然后转入温度30C，相对湿度为75的恒温箱中，再培养3周。当枝条皮层自接种端出现褐色坏死斑后，随机选取10个枝条，切取病健交界处的皮层转入PDA中，分离轮纹病菌。当褐色坏死斑的宽度长于5MM时，记为枝条发病。全部试验在不同时间重复3次，每次重复恒温箱随机分配。14温度对腐烂病菌在木质部内扩展的影响试验设置7个处理温度5C、10C、15C、20C、25C、30C和35C，每个温度接种6个枝条。温度由恒温箱控制，试验前12小时开机并设定相应温度。3月份苹果萌芽前，自5年生的富士苹果树上剪取一年生的健康枝条，用消毒的枝剪，将枝条截成长度为20CM枝段，保持剪口整齐。接种时，用手持喷雾器，将腐烂病菌LXS08090116菌株的分生孢子悬浮液均匀喷布到剪口上，直至剪口处有孢子悬浮液流下。接种后，每个组合处理的枝段套一个塑料袋保湿，然后置于25C恒温箱水培。48小时后，取出接种枝条，6个一组，转入7个不同恒温箱中再培养7天。处理结束将枝条取出,用小刀剥除皮层。然后自接种端开始先以05CM为一个单位，用消毒枝剪从每个接种枝条上依次截取2个枝段，再以1CM为单位，截取4个茎段，以髓部为中心按十字交叉法，将每个茎段平均分成4块枝条组织，经表面消毒后转接到PDA培养基中分离病菌，并在荧光显微镜下检查，统计每个处理同一深度24个枝段中带菌组织的块数和计算带菌百分率。全部试验在不同时间重复3次。每次重复恒温箱随机分配。15剪口木质部接种病菌分生孢子后的发病动态2013年3月24日，在青岛农业大学胶州科技示范园3年生的富士苹果树上，随机选取直径大于08CM的枝条200枝，离基部5CM10CM处剪除枝条，形成剪口，并标记。自3月31日开始，每隔一个月左右接种20个枝条。接种时，用灭菌牙签挑取大麦粒上产生的分生孢子角LXS080901菌株置于剪口木质部中央，用湿润脱脂棉球包裹，外部包扎塑料膜，保湿48小时。接种后，每隔一个月检查记录接种枝条的发病情况，当剪口下方枝段出现长径超过1CM的典型腐烂病斑时，记为发病。2结果RESULTS21露温和露时对腐烂病菌自剪锯口侵染的影响腐烂病菌的分生孢子在5C、10C、15C、20C、25C、30C和35C下均能通过剪锯口侵入苹果枝条的木质部，但不同温度下，分生孢子的侵染数量和侵入菌丝在木质部内扩展的距离有所差异。在距接种点3CM处的枝段上，除35C之外，其他6个温度下接种的枝段上都能分离出腐烂病菌表1。其中，20C下病菌的分离率最高，7个露时共处理63个枝条，切取252块木质部组织，从其中74块组织中分离获得接种的腐烂病菌，分离率为294，与15C、25C和30C接种的枝条没有显著差异，但与5C和10C下接种枝条上病菌的分离率存在显著差异。35C下接种枝条上，3CM处虽没有分离到接种的腐烂病菌，但1CM处能分离到接种病菌，说明35C下腐烂病菌的分生孢子也能从剪锯口侵入木质部。表1不同露温和露时组合下，用腐烂病菌VALSAMALI的分生孢子接种富士苹果1年生枝条的新鲜剪口，接种枝条在25C下培养7天后距接种点3CM处病菌的分离百分率9个枝条36块木质部组织TABLE1UNDERDIFFERENTCOMBINATIONSOFTEMPERATUREANDWETNESS,FLESHPRUNINGWOUNDSOFFUJIAPPLEANNUALTWIGSINOCULATEDBYVALSACONIDIUMANDTHEPERCENTOFINFECTEDTISSUESAT3CMAWAYFROMTHEINOCULATEDENDAFTERCULTIVATEDFOR7DAYSAT25C36XYLEMTISSUESOF9TWIGSTEMPERATURETIME5101520253035MEANS00000002784815569622778481111111925222217350000009922052A100000055696213892406305612731389240683383300000010321579A32784812536323333577425008332784811111192500000014292597A6000000833833250022051111127311119628338330000009131233A120000001111127319441735333330055564811944962000000127168A24222231550000003056459444419252222127355696200000017862504A4827848183314431667288733335069250022052530050000001587254AMEANS3971281BC8731570BC20632930AB29372734A13101527AB14291562AB000000C不同温度下接种枝条3CM处接种病菌的分离率P，与温度T，C/10，模型中采用实际温度的1/10是为了避免模型参数的过小估计的关系可用一元二次模型拟合P2MM才能使病菌孢子从现有的病斑上传播到剪锯口上，传播到剪锯口上孢子，不再需要由降雨或结露提供的水份，便可完成萌发与侵染过程，导致寄主发病。腐烂病菌的分生孢子在5C30C下都能从剪锯口侵染。接种10天后，接种剪口下3CM深处的木质部内都能分离接种的病菌，其中最适侵染温度1969C。轮纹病菌的分生孢子在10C35C的范围内都能从剪锯口侵染，侵染病菌能导致枝条发病。新鲜剪口处渗出的丰富营养能补充两种病菌孢子萌发所需要的营养，进一步增强了病菌孢子对温度的适应性。根据试验结果推断，从3月份苹果萌芽到11月份苹果落叶，环境温度都可以满足两种病菌孢子侵染。因此，在整个生长期内只要条件适宜，腐烂病菌和轮纹病菌的孢子都有可能从剪锯口侵染，而不受温度的制约。311月份，新鲜的剪锯口都能受腐烂病菌的侵染，而3月下旬至5月中旬侵染量最大陈策等，1987。腐烂病菌主要导致苹果枝干的皮层部腐烂，用腐烂病的菌丝块接种皮层在1周内可导致皮层腐烂，表现典型的症状。然而，从剪锯口侵染的腐烂病菌并不能立即致病，在木质部内生长扩展。田间接种试验的结果也表明，从剪口木质部接种的腐烂病菌，接种当年都不发病，而从第二年的春季苹果树萌芽期间大量发病，与自然侵染的腐烂病的发病动态一致（文献）。腐烂病菌在木质部内生长扩展的速度较快，受温度的影响不大，在离体枝条上接种后第10天，在离剪锯口4CM5CM的枝段上都能分离到腐烂病菌。腐烂病菌在木质部内以纵向扩展为主，当菌丝横向扩展到达韧皮部时，可导致皮层发病。春季随苹果树萌芽，水份和养份从木质部内向上输导（文献），从而为木质部内腐烂病菌的生长扩展提供了丰富的营养和水份，加快了病菌的生长和扩展，从而能在短时间内导致大量枝条发病。轮纹病菌主要侵染皮层，导致皮层坏死。轮纹病菌很少从木质部侵染，在接种轮纹病菌的剪口上，从木质部分离获得病菌的百分率近为1702，而从皮层分离获病病菌的百分率为7476（赵旭，2013）。因此，剪口的龄期对轮纹病菌从剪锯侵染有重要的影响。苹果枝条修剪后，剪口下方皮层内形成木栓层。木栓层形成后，阻止了轮纹病菌从剪锯口的侵染。剪锯口皮层内木栓层的形成与树体生长发育密切相关。新鲜的剪口更利于病菌的侵染，随着伤口龄期的增长，剪口的发病率也会降低XUETAL,1998。春季3月份形成的剪口到6月抗性明显增强，此后很少再受轮纹病菌的侵染；7、8月份苹果旺盛生长期形成的剪口，3周后可形愈伤组织，此后轮纹病菌难以从剪口侵染赵旭ETAL,2014。剪口的龄期对腐烂病菌的侵染也能明显的影响。春季形成的剪锯口在6月份之前易受轮纹病菌的侵染，从木质部接种的剪口发病率高；6月份以后受侵染的概率明显降低，从木质部接种的剪口发病率明显降低。本研究中，8月份接种的剪口的发病率较高，其原因有待于深入研究。2013年8月份几乎无有效降雨，气候特别干旱，从而增加了树体的蒸腾拉力和剪口处的渗出营养，这可能是导致2013年8份腐烂病菌侵染率高的一个可能原因。冬剪和夏剪苹果栽培的两项重要措施，苹果树修剪后形成大量新的剪锯口，为腐烂病菌和轮纹病的侵染提供了大量的孔口,春季形成的剪锯口在7月份之前对腐烂病菌的轮纹病菌都非常敏感。在中国的北方的苹果产区，冬春季节降雨很少，病菌产生的分生孢子器和子囊壳大量积累，春季遇雨后，释放大量孢子并散播到新形成的剪锯口上，导致剪口发病。为了防止两种病菌从剪锯口侵染，冬春季尽量推迟苹果树的修剪时间，树体修剪后及时喷施或涂抺持效期长的杀菌剂以保护剪锯口渡过最感病期。同时及时浇水，促进伤口愈合和剪锯口被抽干，可减少轮纹病菌的侵染量。参考文献1TANAKAT1919NEWJAPANESEFUNGINOTESANDTRANSLATIONSMYCOLOGIA11148154,DOI102307/37534202WANGXL,WEIJL,HUANGLL,2011REEVALUATIONOFPATHOGENSCAUSINGVALSACANKERONAPPLEINCHINAMYCOLOGIA,1032,2011,PP317324DOI103852/091653SAKUMAT1990VALSACANKERINJONESAL,ALDWINCKLEHSEDSCOMPENDIUMOFAPPLEANDPEARDISEASESAPS,STPAUL,PP39404UHMJY,SOHNHR1995CONTROLOFAPPLEVALSACANKERBYLOCALIZEDSPRAYINGWITHNEOASOZINSOLUTION,ANARSENICFUNGICIDEKOREANJPLANTPATHOL119165KEPLEYJB,JACOBIWR2000PATHOGENICITYOFCYTOSPORAFUNGIONSIXHARDWOODSPECIESJABORIC263263326BESSHOH,TSUCHIYAS,SOEJIMAJ1994SCREENINGMETHODSOFAPPLETREESFORRESISTANCETOVALSACANKEREUPHYTICA7715187LIUXY,LS,WANGY,WANGK,LITH,HANZH,ZHANGXZ2011EVALUATIONOFRESISTANCEOFMALUSGERMPLASMSTOAPPLECANKERVALSACERATOSPERMAJFRUITSCI2858438488ABEK,KOTODAN,KATOH,SOEJIMAJ2011GENETICSTUDIESONRESISTANCETOVALSACANKERINAPPLEGENETICVARIANCEANDBREEDINGVALUESESTIMATEDFROMINTRAANDINTERSPECIFICHYBRIDPROGENYPOPULATIONSTREEGENETGENOMES73633729FENNEREAALOTOFAPPLESCAUSEDBYBOTRYOSPHAERIARIBISJPHYTOPATHOLOGY,192515130134