炮制对五味子中的5-hmf含量的影响研究 论文正文

毕业论文（设计）题目炮制对五味子中的5HMF含量的影响研究指导老师专业班级生物技术及应用0701姓名学号2010年5月30日摘要本文利用HPLC分析法的建立和验证实验，制定出科学可行的实验分析方法，并通过研究不同的炮制时间、温度和辅料用量对五味子中5羟甲基糠醛（5HMF）的含量影响来探讨五味子中5HMF的主要影响因素，以控制五味子中5HMF含量在高疗效低副作用的范围内。实验表明随炮制时间的延长及炮制温度的升高，五味子中5HMF含量明显增加；随炮制辅料用量的增加，5HMF含量变化呈两种趋势蜜制五味子随炮制辅料用量增加5HMF含量逐渐升高，酒制和醋制五味子随炮制辅料用量的增加而含量逐渐降低，到40G/100G五味子的用量时，辅料量的增加对5HMF产生量的影响变小。5HMF对各炮制因素具一定敏感性，可考虑作为炮制程度的一个评价指标引入到五味子质量控制体系中来。关键词五味子；炮制；5HMF；评价指标目录引言1第一章分析方法的建立21材料与仪器22实验方法23结果与讨论431系统适应性432线性关系433精密度534稳定性535重现性636加样回收率64结论7第二章不同炮制方法对五味子中5HMF含量的影响71材料与仪器72实验操作83结果与讨论931炮制时间对五味子中5HMF含量的影响932炮制温度对五味子中5HMF含量的影响1033炮制辅料用量对五味子中5HMF含量的影响114总结和建议1241实验总结1242建议13参考文献14引言炮制，又称炮炙，是指中药材按照其不同的药性和医疗要求所进行的多种加工方法的总称，也就是药物在应用前或制成各种剂型之前的加工过程14。五味子为木兰科多年生落叶藤本植物，五味子SCHISANDRACHINENSIS（TURCZ）BAILL或华中五味子SCHISANDRASPHENANTHERAREHDETWILS的干燥成熟果实56，前者中国药典2000年版收载为五味子（俗称北五味子），后者收载为南五味子。五味子最早列于神农本草经上品，中药功效在于滋补强壮之力，药用价值极高。关于五味子现代的主要文献记载的炮制方法78有净制、醋制、酒制和蜜制。现今中国药典对五味子收载的炮制方法仅醋蒸一种,而药店出售的五味子饮片多为五味子的蒸制品或醋蒸品。5HMF5羟甲基糠醛，是葡萄糖或果糖等单糖化合物在高温或酸性环境催化等条件下脱水产生的一种醛类化合物，有毒。对眼、粘膜、皮肤有刺激性，能与人体蛋白质结合产生蓄积中毒，造成动物横纹肌麻痹和内脏损害，并且具有神经毒性，且有报道称其存在潜在的遗传及生殖毒性8。现代关于五味子炮制原理910的研究较少，如王琦7关于五味子的炮制作用描述“五味子生品长于敛肺止咳，生津止渴。醋五味子酸敛作用增强，多用于肝肾亏损的滑精、久泻等纯虚证。酒五味子多用于遗精。五味子经炒制后，有祛痰作用的酸性成分及有镇咳作用的挥发油均受到一定程度的破坏或损失，酒制、醋制后挥发油也略有减少，而各炮制品中具有强壮作用的木脂素类成分的含量则均似比生品偏高。醋五味子炮制后有机酸煎出量升高”。为验证不同的炮制方法11对五味子中5HMF含量的影响，我们拟测定酒制、醋制、蜜制和蒸制四种炮制方法下不同时间、温度、辅料用量对5HMF产生量的影响，得出一定的规律,可以将五味子的炮制工艺控制在疗效高、低副作用的水平上，提高我国中药质量，丰富中药理论知识，为生产实践提供技术支持，对将来其它中药成分含量的控制起一定的启发作用。第一章分析方法的建立1材料与仪器11材料与试剂乙腈（色谱纯，德国MERCK公司）超纯水（MILLIQ）5HMF（购自美国SIGMA公司）微孔滤膜（水膜，045M,天津琛航科技有限公司）不锈钢滤头（大连伊利特有限公司）五味子（SCHISANDRACHINENSISTURCZBAILL果实的炮制品，购自北京同仁堂。）12实验仪器电子分析天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司）AGILENT1100高效液相色谱仪（含G1354A四元梯度洗脱泵；G1322A在线脱气装置；G1313A自动进样器，UVVIS检测器，G1316A柱温箱），AGINLENT1100色谱工作站DIAMONSILC18柱（25046MM，5M；DIKMA）加热套（TC15套式恒温器，浙江新医疗器械厂）架盘药物天平（马头牌BPII型，上海医用激光仪器厂）2实验方法21供试液的制备125G北五味子加入250ML去离子水后，浸泡2H后称重，进行煎煮保持微沸1小时，冷却后称重加水至原重，过滤，滤液用045M的微孔滤膜水膜过滤后作为供试液待测。22色谱分析条件及系统适应性考察色谱柱DIAMONSILC18柱（25046MM，5M；DIKMA），流动相水乙腈955V/V，流速10MLMIN1，检测波长280NM，进样量1L，检测时间20MIN。观察供试液中色谱峰的对称性、分离度和理论塔板数是否符合药典规定。23工作曲线的建立5HMF储备液制备1362MG5HMF加入50ML容量瓶中，用纯水定容至刻度，作为储备液于4条件下保存。分别将储备液稀释为2724,5448,8172,10896,1362,16344,2724MG100ML1的标准溶液。将标准溶液用045M的微孔滤膜水膜过滤后按上述分析条件进行HPLC分析。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，得浓度与峰面积工作曲线。24精密度考察将配制的标准溶液和样品溶液都根据上述分析方法分别重复进样六次，计算六次所得峰面积的相对标准偏差。25稳定性考察将标准溶液和供试品溶液分别隔2H，4H，6H，8H，10H，12H，24H进样，根据上述分析方法进行分析，计算各自在24小时内峰面积的相对标准偏差。26重现性考察125G生五味子加250ML去离子水，浸泡2H，称重，保持微沸1H后称重，加水至原重，微孔滤膜过滤后做HPLC分析。在相同条件下制备6个样品溶液，计算6个供试液5HMF峰面积的相对标准偏差验证供试液的批次差异是否在可信范围。27加样回收率考察在已知浓度的样品中加入一定量的5HMF，根据上述方法测定5HMF的含量，根据测定结果，计算出回收率。3结果与讨论31系统适应性流动相为配比为955,V/V的水乙腈时可达到较好的分离效果，分离度15，理论塔板数为4000，峰对称性为096，均可达到我国药典对药物分析的要求。该分析方法能够避开供试液中其它物质对5HMF的检测干扰。有代表性的色谱图见图31。A5HMF标准溶液谱图B炮制五味子煎煮液图谱图31标准溶液和供试液的色谱图32线性关系以5HMF的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标作图，得出5HMF峰面积与浓度线性关系见图32。5HMF标准溶液的线性方程Y73768X68016，R209999，结果表明5HMF含量在002724到02724MGML1范围内与峰面积有良好的线性关系。图325HMF的标准曲线33精密度6个标准溶液和样品溶液的RSD（相对标准偏差）分别为014和071，分析仪器的分析误差在可信范围内。具体数据见表31和表32。表31标准溶液的精密度数据表32样品溶液的精密度数据峰面积平均值RSD3901390339013904390639163905014峰面积平均值RSD34稳定性结果显示5HMF标液和供试液在24小时内有较好稳定性。标液和供试液24小时内测定值RSD分别为015和123。标准溶液和样品溶液稳定性数据见表33和表34。表33标准溶液的稳定性数据表34样品溶液的稳定性数据时间（H）峰面积平均值RSD2706470586703887065107069127059247058705801535重现性在相同条件下制备的6个五味子样品中5HMF含量差别不大，6个数据的RSD值为158，样品的重现性数据见表35。表35样品的重现性数据样品峰面积平均值RSD样品15788样品25957样品3601959531585506553254245449547254785477071时间（H）峰面积平均值RSD259144589166042860391060071259642458885964123样品45914样品56053样品6598436加样回收率煎煮液中5HMF的平均加样回收率为9889，相对标准偏差278，平均加样回收率在95105之间，符合药典常用的分析标准。5HMF加样回收率数据如表36。表365HMF加样回收率数据样品检测到量MG加入量MG加样回收率平均值RSD1134613629883213041362957731364136210012413301362976651325136297316141213621036598892784结论采用如下的分析条件色谱柱为DIAMONSILC18柱（25046MM，5M；DIKMA），流动相为水乙腈955V/V，流速为10MLMIN1，柱温为25，检测波长为280NM，进样量为1L10L，检测时间为20MIN，可以直接分析五味子煎煮液中5HMF含量，达到较好分离效果。5HMF分离度15，理论塔板数为4000，峰对称性为096，均符合我国药典对药物分析的要求。样品中5HMF精密度的RSD为071，稳定性RSD为123，重现性RSD为158，平均加样回收率为9889，能够避开供试液中其它物质对5HMF的检测干扰，达到分析要求。采取直接进样法可以有效地避免在样品前处理过程中人为造成的误差，而且可以排除煎煮液中其它杂质对检测的干扰。本分析方法样品处理简单，重现性好，所用分析时间短，可以应用于后面各实验中5HMF的定量和定性分析。第二章不同炮制方法对五味子中5HMF含量的影响1材料和仪器11材料和试剂生五味子为木兰科植物五味子SCHISANDRACHINENSISTURCZBAILL的干燥、成熟果实，购自同仁堂，经浙江中医学院中药系陈孔荣教授鉴定，符合2005年版中华人民共和国药典。黄酒金谷黄酒，杭州金谷酒业有限公司，400G/袋，糖度150G/L，酒精度140（V/V）米醋双鱼米醋，杭州食品酿造有限公司，总酸35G/100ML蜂蜜枣花蜜纯净水杭州娃哈哈集团12实验仪器电子分析天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司）水浴锅（余姚新波仪表公司）加热套（TC15套式恒温器，浙江新医疗器械厂）微孔滤膜（水膜，045M,天津琛航科技有限公司）2实验操作（1）炮制炮制时间的影响取100G生五味子置于密封保鲜盒中，加入黄酒（米醋、蜂蜜30G、纯净水）20G，待辅料被五味子吸干后，置于水浴锅中，分别煮沸（100）炮制2H、4H、6H、8H。炮制温度的影响取100G生五味子置于密封保鲜盒中，加入黄酒（米醋、蜂蜜30G、纯净水）20G，待辅料被五味子吸干后，置于水浴锅中，分别于75、80、85、90、95、100下炮制4H。辅料用量的影响取100G生五味子置于密封保鲜盒中，加入黄酒（米醋、蜂蜜）10G、20G、40G、60G、80G、100G，待辅料被五味子吸干后，置于水浴锅中，煮沸（100）炮制4H。（2）制样分析取125G五味子样品于圆底烧瓶中，加入250ML去离子水，浸泡2H，称重，保持微沸煎煮1H，冷却后称重补重，过滤，再用微孔滤膜过滤，作HPLC分析。3结果与讨论31炮制时间对五味子中5HMF含量的影响炮制时间对五味子中5HMF的影响的结果见表31和图31。从图表中可以看出五味子中5HMF的浓度随炮制时间的加长而增加，蜜制后的浓度远远高于蒸制、醋制和酒制，而蒸制、醋制和酒制三种制法的差别并不是很大。表31炮制时间对五味子中5HMF的影响5HMF浓度（MG/100ML）炮制时间（H）蜜制酒制醋制蒸制246816273342377440174266056488333153766471258887396710650510152025303540452468炮制时间（H）5HMF浓度（MG/100ML）蜜制酒制醋制蒸制图31炮制时间对五味子中5HMF的影响32炮制温度对五味子中5HMF含量的影响炮制温度对五味子中5HMF的影响的结果见表32和图32。从图表中可以看出五味子中5HMF的浓度随着炮制温度的升高，蜜制后的浓度明高于其他三种制法，且其升高幅度大于其他制法；蒸制、醋制和酒制的差别并不是很大；80时四种制法没有什么差别，80以前变化也不明显，这正应证了五味子高温条件对5HMF生成的催化作用。表32炮制温度对五味子中5HMF的影响5HMF浓度（MG/100ML）炮制温度（）蜜制酒制醋制蒸制758008834114515912414165185857442772171990193926326334795221281311529100377460553787305101520253035407580859095100炮制温度（）5HMF浓度（MG/100ML）蜜制酒制醋制蒸制图32炮制温度对五味子中5HMF的影响33炮制辅料用量对五味子中5HMF含量的影响炮制辅料用量对五味子中5HMF的影响见表33和图33。从图表中可以看到，蜜制后五味子中5HMF浓度随蜂蜜加入量的增加而增加，而其他两种制法却正好相反，而且蜜制后的含量远远高于酒制、醋制；酒制和醋制的差别并不是很大。表33炮制辅料用量对五味子中5HMF的影响5HMF浓度（MG/100ML）辅料用量（G）蜜制酒制醋制10130771261420239860553740385546445160389342641580408638439610041173323820510152025303540451020406080100辅料用量（G）5HMF浓度（MG/100ML）蜜制酒制醋制图33炮制辅料用量对五味子中5HMF的影响我们可以从以上结果发现四种炮制因素中，炮制辅料用量对五味子中5HMF的浓度影响明显大于其他三种，且其中蜜制后的五味子中5HMF的含量远远高于蒸制、酒制和醋制后的五味子，所以炮制辅料用量是五味子炮制过程中5HMF的主要影响因素。4总结和建议41实验总结在研究中发现，随炮制时间的延长及炮制温度的升高，五味子中的5HMF含量逐渐增加。随着炮制辅料用量的加大，5HMF含量变化呈两种趋势蜜制五味子随炮制辅料用量加大而含量逐渐升高，酒制和醋制五味子随炮制辅料用量的加大而含量逐渐降低，但到40G/100G五味子以上的用量时，辅料量的增加对5HMF产生量的影响变小。和对炮制黑润程度这个感观指标的影响相比，五味子中5HMF含量对炮制时间、炮制温度及炮制辅料用量均有一定敏感性，可以考虑作为一个五味子炮制程度的质量指标对五味子的炮制程度控制进行指导。42建议H