脂滴结合蛋白通过分子蛋白介导的自噬降解帮助脂肪分解

细胞与医学遗传学实验文献翻译文献标题DEGRADATIONOFLIPIDDROPLETASSOCIATEDPROTEINSBYCHAPERONEMEDIATEDAUTOPHAGYFACILITATESLIPOLYSIS期刊来源NATURECELLBIOLOGY脂滴结合蛋白通过分子蛋白介导的自噬降解帮助脂肪分解SUSMITAKAUSHIK1,2ANDANAMARIACUERVO分子蛋白介导的自噬（CMA）能够选择性地在溶酶体中降解胞浆蛋白的一个亚型。营养剥夺能够有效激发分子蛋白介导的自噬，同时细胞内储存的甘油三酯或脂滴也会水解（脂解）来产生自由脂肪酸来供能。在本文中，我们将介绍脂滴结合蛋白PERILIPIN2PLIN2和PERILIPIN3PLIN3是分子蛋白介导的自噬作用的底物，并且这两种蛋白通过这一途径进行的降解发生在脂解之前。活体实验揭示了PLIN2和PLIN3通过分子蛋白介导的自噬途径发生的降解在饥饿状态增强，同时伴有脂肪组织甘油三酯水解酶和巨自噬蛋白对脂滴的高作用水平。分子蛋白介导的自噬。在培养的细胞或老鼠肝中阻断分子蛋白介导的自噬或抗CMA的PLIN蛋白的表达会导致脂肪组织甘油三酯水解酶和脂自噬相关蛋白与脂滴的结合，继而导致脂质氧化的减少和脂滴的堆积。我们认为分子蛋白介导的自噬对于脂滴生物学及对脂肪动态平衡的维持有重要作用。自噬作用通过在溶酶体内降解蛋白质、脂质和细胞器维持了细胞的动态平衡。失去作用的细胞器通过自噬而更新确保了质量的控制，降解产物的再利用能为机体提供能量。在分子蛋白介导的自噬作用（后文均记作CMA）中，热休克蛋白70同源蛋白（HSC70）通过五肽模体识别蛋白并把蛋白运转到溶酶体表面，与溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2AL2A）结合，这是CMA作用的限速步骤。L2A组装成多聚体复合物，和溶酶体中的HSC70一同介导未折叠底物转移到溶酶体中进行降解。CMA在哺乳动物大部分细胞中均存在，并且在长时间饥饿、温和的氧化胁迫、组织缺氧和脂肪合成后被最大程度地激活。溶酶体对LAMP2A稳定性的降低会导致衰老细胞器CMA活性的降低。除了已有良好定性的通过自噬的细胞更新，脂质也可通过巨自噬进行降解，通过内吞作用进入双膜囊泡（自噬体）并与溶酶体融合。自噬介导的脂解选择性地靶向脂质，脂质是细胞内作为能量储备的脂肪储存，能通过水解甘油三酯为游离脂肪酸来供能。脂滴被PERIPILIN（PLIN）家族的结构蛋白包围，PLIN1主要存在与脂肪细胞，PLIN2和PLIN3在各种细胞中广泛存在。脂解能够在胞浆脂酶如ATGL的催化下进行，也能在溶酶体腔内的脂酶作用下进行，后者发生在自噬相关蛋白在脂滴表面装配形成自噬体，吞噬部分脂滴并将其定位进入溶酶体。尽管CMA只能降解蛋白质，不能降解脂肪，但肝脏CMA受到阻断的老鼠表现出确定的脂肪变性，即使非选择性的巨自噬功能完好。由于脂肪合成酶通过CMA降解减少而导致的分散的脂肪合成的增加不足够解释老鼠肝脏的大量脂肪堆积。这一发现，加上在诸如肝等组织，脂质的大量涌入，脂解和CMA达到最大速率激活发生在饥饿状态；而CMA活性随年龄增长而降低，常伴随发生细胞内的脂堆积，促使我们来进一步研究CMA在调控脂肪动态平衡中的作用。本文中，我们展示了在细胞内和老鼠肝，CMA的阻断均会减少脂滴的溶解。在增强脂解的条件下，CMA降解脂滴相关蛋白PLIN2和PLIN3，这还有助于脂滴结合胞浆脂肪酶ATGL及巨自噬相关蛋白ATG。减少的CMA会阻碍脂肪分解所需物质的补充，因此我们认为CMA对脂滴巨自噬和胞浆脂解是重要的上游调控。结果LAMP2A缺陷细胞出现脂滴堆积现象我们使用了在肝细胞中敲除LAMP2A（L2AKO）的老鼠肝脏和敲除了L2A的老鼠成纤维细胞（L2A）来阻断CMA。借此我们证实了，尽管和肝细胞相比，成纤维细胞对脂肪代谢的需求很小，L2A缺乏的成纤维细胞比对照组显著地有更多甘油三酯堆积。当我们在培养基中减少葡萄糖或给予脂肪生成的刺激（OL）时，细胞内对脂肪的利用被刺激，甘油三酯水平的差异更显著。与对照组相比，我们在L2AKO组老鼠的L2A敲除细胞仅发现了微小的甘油三酯合成增加的趋势。与之相反，L2A细胞表现出有显著差异的氧化速率的降低，这是甘油三酯水解的下游反应，基态或脂肪生成的条件下均如此；此外，L2A细胞无法在OL暴露下加快氧消耗的速率（OCR）。L2A细胞降低的氧化速率本质上不是由于线粒体缺陷，因为具有完好的膜电位的线粒体百分数以及线粒体更新和CTR细胞是相似的。对照组和L2A细胞氧化速率的差异在乙莫克害存在下显著减少，这暗示出现脂滴堆积在本质上是由于脂肪动员出现问题，而非氧化步骤的问题。与L2AKO老鼠显著的脂肪肝现象一致的是，L2A成纤维细胞堆积更多、更大的脂滴，在正常条件或OL暴露条件下均如此。与对照组不同，加入乙莫克害的L2A细胞无法增加脂滴，支持了脂肪动员缺陷的猜测。为了进一步检测这一假说，我们使用不同的实验模型来促进成纤维细胞的脂解。OL刺激的对照组细胞，在移除OL时表现出脂滴数量和体积的减少，而在无血清培养皿中则更显著。反之，OL刺激的L2A细胞则始终保持脂滴数目和体积的增加。相似地，为了帮助细胞利用储存脂质，我们在低糖或无血清培养基里培养细胞，展现出了L2A细胞降低甘油三酯水平及脂滴容量能力的显著降低。电镜下观察证实了在CMA缺陷细胞中，脂滴数目、平均体积以及所占细胞空间都高于对照组，在实验所有条件下均如此。L2A细胞中的脂滴堆积是L2A丧失的直接后果，因为L2A在这些细胞中的表达就对照组细胞水平而言足够减少脂滴。综上所诉，这些结果表面，CMA的阻断会导致脂滴堆积，并且这主要是脂滴无法正常减少的后果。脂滴蛋白PLIN2和PLIN3是CMA作用的底物由于只有蛋白质可以作为CMA的底物，脂质不可以，我们接下来研究了CMA对于脂滴蛋白质降解的作用，这将能解释在CMA阻断细胞中脂滴利用缺陷的原因。对PLIN2和PLIN3蛋白进行免疫印记法和免疫荧光实验，L2A细胞在基态条件、OL刺激和后期OL刺激条件下都表现出显著的更高水平的蛋白表达。与已知的PLIN2蛋白通过泛素蛋白酶体通路的更新相一致，对照组细胞中蛋白酶体抑制剂增加了脂滴数量和PLIN2水平，但在CMA阻断细胞中没有出现这一现象，尽管蛋白酶体对泛素化蛋白和降解决定因子GFP的降解速率是正常的。我们对比了脂滴在蛋白酶体或溶酶体被抑制后发生的堆积情况，发现了一种可能性PLIN蛋白也能被溶酶体降解。为了验证CMA对PLIN2、PLIN3降解的可能的作用，我们首先探究了它们与溶酶体的联系。能够支持PLIN蛋白经溶酶体作用更新的一个现象是，在对照组细胞用氯化铵及亮抑酶肽抑制溶酶体途径降解显著增加了PLIN2或PLIN3与溶酶体标记物的共定位，在OL刺激条件下这一增加更显著。相反的，L2A细胞表现出PLIN2及PLIN3与溶酶体的结合减少以及溶酶体抑制剂不稳定状态的修复。与CMA反应不活跃的细胞相比，CMA活跃的细胞中PLIN2和PLIN3在溶酶体中的含量更高。L2A细胞中，PLIN2和PLIN3在溶酶体内的含量都降低。我们证实了在活体内溶酶体与PLIN2/3的结合会引发它们的降解，因为用亮抑酶肽阻断饥饿状态老鼠溶酶体蛋白质水解2小时，足够增加CMA活跃的细胞中脂滴蛋白在溶酶体中的含量。PLIN2的CMA途径降解在饲养充足的老鼠细胞内也有发现，虽然比饥饿状态老鼠降解的程度低；而PLIN3通过溶酶体的降解在饱食动物体内进行的程度可以忽略不计。我们发现PLIN蛋白在CMA阻断细胞的溶酶体中也存在一些降解，可能是因为通过脂巨自噬进行的降解，因为这些溶酶体优先与自噬体结合。综上所述，体外和体内实验都证明CMA途径可降解PLIN2和PLIN3。PLIN蛋白和分子伴侣HSC70互相影响进行CMACMA反应的第一步就是底物与HSC70相互作用，为接下来的溶酶体定位做准备。当实验大鼠肝脏的脂解作用活跃时，PLIN2和PLIN3含量降低的同时，我们还在分离出的老鼠肝脏脂滴中发现了HSC70，并且含量随着饥饿状态持续而增长。免疫荧光检测法证实了在脂滴中，HSC70和每个PLIN蛋白都是共同定位的，并随着OL刺激而加强（OL刺激能够诱发脂解）。在OL刺激后把细胞置于无血清培养基来诱发脂动员，这会减弱HSC70与脂滴的结合。明显地，L2A细胞中，HSC70在所有条件下都与脂滴中的PLIN2或PLIN3有更好的共定位。同样地，L2AKO组老鼠肝中分离出的脂滴中也发现比对照组更高含量的HSC70。我们在培养的细胞中发现了HSC70与PLIN2或PLIN3直接的相互作用。我们在折叠式PLIN2和3中发现了HSC70，同样也在折叠式HSC70中找到来PLIN蛋白。折叠相同量的PLIN，我们发现在L2A细胞中有更多的被结合的HSC70。当细胞中的CMA由于溶酶体受体被敲除而阻断，但HSC70与底物的识别还完好时，底物与HSC70的结合会特征性地增加。这种增加的、HSC70和多个底物的结合解释了为何未在HSC70折叠中发现更高水平的PLIN蛋白。当对L2A细胞施以更高浓度的OL刺激来提高CMA活性时，HSC70与PLIN2或PLIN3结合的程度大大提高，而在对照组细胞中，它们的结合水平保持不变，支持了LD蛋白通过CMA而不断更新的猜想。PLIN2和脂滴的结合位点几乎是专一的，与之相反的是，PLIN3在细胞的其他区室也存在。我们分离出老鼠肝脏的脂滴并证实有HSC70和PLIN蛋白的相互作用的发生。这些结果与PLIN和分子伴侣HSC70在脂滴表面被识别、而后进行CMA介导的降解的理论是相协调的。CMA靶向的PLIN蛋白的修饰为了进一步证实CMA参与OLIN更新，我们使用了非典型的维甲酸衍生物来激活OL刺激细胞的CMA途径。化学激活CMA显著减少了对照组细胞内PLIN蛋白和脂滴的含量，但L2A细胞却非如此，事实上，通过瞬间的转染来恢复L2A细胞内的L2A水平已经足够使得细胞内的PLIN蛋白水平达到与对照组相近的值。为了识别出出发PLIN进行CMA降解的可能的翻译后修饰，我们采取了二维电泳疗法和免疫印记法并发现了两个十分突出的PLIN2的形式，等电点分别为56和59，还有一种较少量的异构体，等电点为53。当OL刺激诱发脂解和后续的PLIN2降解，含量较少的异构体在对照组细胞中不再存在，但在L2A细胞依然存在。用磷酸酶处理细胞证明了对照组细胞中，PLIN2在脂解过程中被磷酸化修饰，但在L2A细胞中未被磷酸化修饰，因为细胞内的PLIN2在磷酸酶的作用下不反应。使用PHOSTAG来电泳分析脂滴证实来在对照组细胞中存在PLIN2的一种被磷酸化的形式，但在L2A细胞中几乎不存在。尽管要阐明为什么CMA功能确实的细胞中磷酸化修饰的PLIN2含量低还需要进一步实验，但我们的研究表明了PLIN2的磷酸化可能是触发CMA降解所必需的。抗CMA途径的PLIN2导致脂肪变性HSC70通过一个五肽模体结合CMA底物。PLIN3具有一个典型的CMA模体（100LDRLQ）而PLIN2具有一个推断的模体（414SLKVQ）。为了排除其它CMA阻断带来的变化而单独分析阻碍PLIN2降解的后果，我们使PLIN2的CMA靶向位点414SLKVQ发生突变。对照组细胞中野生型PLIN2和CMA突变的PLIN2GFP导致了更高含量的CMA突变PLIN2GFP，脂滴含量和体积比表达野生型PLIN2的细胞增加了多至27倍，在正常条件和OL刺激下均是如此。突变型PLIN2GTP的堆积主要是由于溶酶体降解的减少，证据是加入溶酶体抑制剂使得野生型PLIN2增加，但突变型PLIN2GFP含量不增加；此外，与野生型PLIN2不同，加入溶酶体抑制剂也无法增加突变型PLIN2与溶酶体标记物LAMP1的共定位。我们证实了破坏PLIN2的CMA靶向作用模体几乎完全消除了PLIN2与HSC70的结合，解释了为何在表达突变型PLIN2细胞内HSC70与脂滴的共定位会减少。脂滴中突变型PLIN2的留存改变了它们的细胞动力学以及与溶酶体的相互作用。因此，同时表达野生型和突变型PLIN2的细胞的活细胞成像图像揭示出野生型PLIN2GFP脂滴主要是很小且易于移动的，此外还表现出脂滴间动态的结合以及脂滴与溶酶体间的KISSANDRUN型内吞。于此形成明显反差的是，表达突变型PLIN2的细胞中的大部分脂滴都变得更大，聚集成群而活性下降，而极少数的较小的脂滴也几乎不与溶酶体结合。总而言之，阻碍PLIN2通过CMA的降解足够诱发细胞内的脂堆积并减少脂滴与溶酶体的相互作用。PLIN的CMA途径缺失会阻碍脂解脂滴中的甘油三酯在胞浆脂肪酶或溶酶体脂肪酶的作用下会分解成自由脂肪酸，其中，溶酶体脂肪酶通过脂滴巨自噬与之结合。为了检测哪一种脂解通路无法在L2A细胞启动脂肪动员，我们用脂肪酶抑制剂甲基伞形酮磷酸酯和溶酶体抑制剂（NL）一起处理细胞，发现对照组细胞的氧化减弱，但L2A细胞维持无反应。统观这些发现，表明了阻碍CMA会损害通过磷酸酶或脂滴巨自噬进行的脂解。ATGL是大部分类型细胞的胞浆限速脂解酶，它在刺激脂肪生成的条件下和脂滴共定位来诱发脂肪分解。相似地，化学激活CMA会增加ATGL与脂滴的共定位。相反地，CMA缺陷的细胞在所有的情况下都表现出ATGL与脂滴结合的显著的降低，尽总体上ATGL的含量并未改变，表明了这种脂肪酶无法与脂滴结合。在CMA阻断细胞中，ATGL脂肪分解酶活性的降低不能归咎于它与内源的调节器的结合的改变，因为，在相反的情况中，在L2A细胞中抑制ATGL后表现出它与其抑制剂G0/G1开关基因的结合的减少，并增强它与其共激活基因的结合，可能反映了细胞对于支持脂解的补偿效应。活体内相似的变化发生，当老鼠处于饥饿状态时，ATGL和老鼠肝脂滴的结合增强，饥饿状态既会激活脂解，也会激活CMA，但L2AKO大鼠肝中分离出的脂滴表现出一种不相关却一贯的ATGL含量降低，以及它的共激活基因CGI58的显著降低。此外，抗CMA途径的PLIN2而非野生型PLIN2的表达，足够使ATGL和脂滴的结合显著降低。因此，在CMA阻断细胞中，无法将PLIN2从脂滴移除导致了脂解的减少，部分原因是胞浆脂肪酶ATGL和脂滴的结合被损坏。为了研究在CMA阻断细胞中，依赖溶酶体的噬脂活动降低的原因，我们首先分析了巨自噬阻断时，脂滴数量的改变。3甲腺嘌呤的增加能够减少对照组和L2A细胞的巨自噬，但仅在对照组细胞中增加了脂滴数量。相似地，用纳巴霉素上调细胞的巨自噬，使得对照组细胞表现出比L2A细胞更显著的脂滴含量减少。CMA缺陷细胞内体现出的这些脂滴巨自噬的减少，与之前所报道的这些细胞中的无选择性的巨自噬的增加形成鲜明对比，这一现象我们在LC3着色实验中进行了确实。为了探究脂滴无法进行巨自噬的原因，我们对肝脏细胞的脂解作用在长期饥饿后被激活情况下，以及OL刺激下的成纤维细胞进行了巨自噬蛋白对脂滴作用增强的分析。对L2A细胞进行共免疫染色发现，脂滴与巨自噬起始化合物组分、自噬体延长所需蛋白（ATG5）以及自噬体结构成分的共定位显著降低。我们还分析了两种货物识别蛋白，发现L2A细胞中的脂滴与NBR1的共定位较弱，而在通常情况下两者的共定位在脂解过程中是增加的，而脂滴与P62的共定位则与正常情况下相同，保持不变。脂滴与ATG7介导自噬体延长的连接酶的共定位保持不变，而其它ATG蛋白比如ULK1，ATG9及UVRAG与脂滴不进行共定位，在对照组细胞与L2A细胞中均如此。溶酶体介导的脂解所需要的RAB7与脂滴的共定位在L2A细胞中也显著减少。使用分离的肝脏脂滴进行的体内实验分析证实了L2A组老鼠与对照组相比，LC3，ATG5，BECLIN1及NBR1的含量减少。此外，甚至在CMA正常的情况下，抗CMA的突变PLIN2蛋白的表达已经足够显著减弱LC3，ATG5，BECLIN1与脂滴的结合，证实了无法通过CMA降解LDPLINS结合物阻碍了巨自噬相关因子与脂滴的结合。我们提出，ATG如果无法在脂滴表面锚定将会阻碍脂滴巨自噬的起始。超微结构分析证实了在对照组细胞中较大的脂滴观察到的诱导脂解的膜状结构早先被认为是脂滴巨自噬的信号，在L2A细胞的脂滴中是完全没有的。统而观止，这些结果表明通过CMA移除PLIN促进脂滴的巨自噬。总而言之，我们提出，通过CMA降解脂滴结合蛋白PLIN2和PLIN3是脂滴与胞浆脂肪酶和巨自噬效应蛋白结合都需要的，而随后发生的脂解反应解释了CMA损坏细胞内观察到的脂肪堆积。讨论本文中，我们展示了CMA在细胞内通过降解脂滴蛋白PLIN2和PLIN3来调控脂肪动员的作用。除去这些脂滴蛋白是后续脂解发生的先决条件，因为如果无法通过CMA除去这些蛋白会减少脂滴与胞浆脂肪酶和脂滴巨自噬相关蛋白的结合。脂滴中的甘油三酯被胞浆脂肪酶分解产生自由脂肪酸，在线粒体进行氧化，或通过巨自噬的途径被溶酶体脂肪酶降解。ATG和ATG阳性细胞膜在脂解过程中可在脂滴中检测到，暗示自噬体限制在脂滴表面形成膜。事实上，近期的研究表明脂滴是自噬体生源论的一个位点。我们发现在自噬体选择性地隔离脂滴前需要CMA反应，表明为了使ATG和自噬体结合并启动自噬反应，脂滴周围的蛋白需要被从脂滴表明除去。因此，可以将大部分巨自噬归因于在CMA阻断细胞中观察到的唯一剩下的脂肪酶，在这些细胞中含量上调，并且不需要货物识别过程。胞浆脂解受到PLIN蛋白与脂肪酶之间复杂的互相作用的调控。ATGL和脂滴在最大脂肪分解的情况下结合脂滴，而脂滴表明的PLIN发挥一种屏蔽作用，调节甘油三酯与脂肪酶之间的接触。如此看来，PLIN的过表达会降低脂滴与ATGL的结合，并因此降低脂解作用。我们认为，CMA通过从脂滴表面除去PLIN帮助脂解，因为我们发现当细胞中PLIN含量升高时，ATGL与脂滴的结合减少，因为受损的CMA或CMA突变基因的表达。此外，除去PLIN还能帮助共激活剂与已经连接于脂滴的ATGL结合，因为阻断CMA会降低脂滴中CGI58的含量。尽管PLIN已经被报道为一种蛋白酶体的底物，溶酶体和蛋白酶体都能降解相同的蛋白质，这取决于细胞的需求或细胞类型，PLIN1即是如此。在我们的研究中，我们发现溶酶体和蛋白酶体都能降解PLIN2，但有趣的是，阻断CMA也会阻碍PLIN2通过蛋白酶体途径的降解。尽管看起来CMA可能真的能非直接地帮助蛋白酶体降解PLIN2，但我们的数据并不支持这一看法，因为PLIN2直接和HSC70相互作用；我们在CMA活跃地溶酶体中检测到PLIN2及其降解；而清除CMA靶向模体使得脂滴中地PLIN2保留下来。我们因此提出，PLIN2由HSC70直接识别，并靶向CMA降解。蛋白酶体可能只能在PLIN降解已经被CMA引发起始后才能与其结合作用，或者PLIN