关于b基因表达产物与心肌细胞缺血损伤之间的关系及ａ药物与ｂ基因表达产物相互作用的实验

细胞与医学遗传学实验实验设计实验名称B基因表达产物与心肌细胞缺血损伤的关系及B基因表达产物与A药物保护心肌细胞的关系关于B基因表达产物与心肌细胞缺血损伤之间的关系及药物与基因表达产物相互作用的实验一、实验目的已知A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用，且心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。本实验通过设计实验来证明（1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血之间的关系。（2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中。二、实验原理（1）体外模拟心肌细胞缺血模型建立体外心肌细胞缺血模型，能够使我们从细胞水平来研究心肌细胞缺血过程中，发生的改变与反应。取小鼠的心肌细胞并进行培养，以缺血液（无糖）及高纯氮气（95N2、CO2）持续通气，来建立心肌细胞的缺血模型。（2）免疫细胞化学技术免疫细胞化学（IMMUNOCYTOCHEMISTRY）即将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，再用标记了生物素、荧光素等的二抗结合一抗，二抗再与标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（链酶亲和素等）结合，最后通过显色反应或荧光反应来显示细胞中的抗原。在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，籍此对细胞内某抗原作定性、定位以及定量检测。链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物技术（SABC技术）利用链霉亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶，其对生物素分子亲和力极高，对组织和细胞的非特异吸附很低，因此该方法背景很低。DAB显色HRPH2O2HRPH2O2（HRP辣根过氧化物酶）HRPH2O2DH2HRPD2H2O（DAB3,3二氨基联苯胺）产物为棕黄色（3）CCK8比色法细胞活力测定CCK8试剂中含有WST8（22甲氧基4硝基苯基34硝基苯基52,4二磺酸苯2H四唑单钠盐），它在电子载体1METHOXYPMS（1甲氧基5甲基吩嗪硫酸二甲酯）的作用下，被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒，且生成甲瓒的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450NM波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。三、器材与试剂1材料小鼠2仪器96孔细胞培养板、酶标仪、移液枪、枪头、滴管、显微镜、解剖刀、镊子、离心机、离心管、缺氧培养箱3试剂缺血液、甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAB、03H2O2PBS、DMEM培养液、II型胶原酶、透明质酸酶、A药物、CCK8工作液（原液无血清高糖DMEM110）模拟缺血液NACL118MMOL/L，NAHCO324MMOL/L，KCL16MMOL/L，KH2PO410MMOL/L，CACL225MMOL/L，MGCL212MMOL/L，NAEDTA05MMOL/L，乳酸钠20MMOL/L，将PH调为62，置于4C冻存。PBS磷酸盐缓冲液（001M，PH72）封闭液5牛血清白蛋白（BSA，即用型）一抗小鼠IGG（抗小鼠、抗大鼠、抗人），用时PBS稀释（1300）二抗山羊抗小鼠IGG生物素化SABCAVIDINBIOTINPEROXIDASECOMPLEX链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物DABDIAMINOBENZIDINE显色液试剂盒3,3二氨基联苯胺、TBS、H2O2四、实验步骤1B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系（1）心肌细胞培养取小鼠10只，处死，取出心脏，用PBS清洗34次，去心包膜及心房。将心室剪碎至1MM3左右的颗粒，加入5ML透明质酸酶II型胶原酶混合酶，于37C消化20MIN，轻轻吹打，静置1MIN后收集上清液，加入DMEM培养液终止消化。过滤，离心并弃上清液，加入4ML培养液吹打成细胞悬液，接种于四个不同的96孔板（分别为对照组、缺血1H、2H、4H），每组3孔，37C、5CO2孵箱中培养，每24H换液一次。培养至第5天的细胞用于实验。（2）体外心肌细胞缺血模型的建立吸弃原培养液，用PBS洗三次，每次都轻轻晃动96孔板。向缺血1H、2H、4H组加入缺血液，对照组依然加入DMEM培养液。将缺血组96孔板放入缺氧装置中，冲入高纯氮气（95N2、CO2），流量10L/MIN，大约30MIN左右，用O2CO2浓度检测仪测得O2浓度1时，同时关闭进气口与出气口，放入孵箱中培养。分别培养至预计时间后取出。（3）固定吸弃培养液，PBS洗，轻轻摇动后小心吸弃，重复3次，加入甲醇固定5MIN。（4）封闭PBS洗3次，加入25L封闭液，37C培养30MIN，吸弃上清液。（5）每孔加一抗25L，37C培养2H后置于4C冰箱过夜。（6）吸弃上清液并用PBS洗3次，加入二抗25L，37C培养2H。（7）吸弃上清液并用PBS洗3次，加入30L03H2O2PBS，37C培养30MIN。（8）吸弃上清液并用PBS洗3次，加入25LSABC工作液（即用型），37C培养30MIN。（9）吸弃上清液并用PBS洗3次，用三蒸水稀释DAB显色液（20倍），混匀后加入96孔板，每孔25L，镜下控制，细胞被染上色后，即以蒸馏水终止反应。（10）吸弃上清液，加入适量蒸馏水，观察结果。2B基因的表达产物是否参与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程（1）分组传代心肌细胞至96孔板，分四组（阴性对照组（缺血、不给药）、加A药物20MOL/L、40MOL/L、60MOL/L），每组4孔（两孔用作细胞活力检测，两孔通过免疫细胞化学检测B基因表达产物）。另取一个96孔板，传代心肌细胞至其中的4孔，用作阳性对照（不缺血、不加药）（2）体外心肌细胞缺血模型的建立培养心肌细胞24H后，缺血组吸弃原培养液，加入适量缺血液，实验组分别加入浓度为20MOL/L、40MOL/L、60MOL/L的A药物，96孔板放入缺氧装置中，冲入高纯氮气（95N2、CO2），流量10L/MIN，大约30MIN左右，用O2CO2浓度检测仪测得O2浓度1时，同时关闭进气口与出气口，放入孵箱中培养4H后取出。（3）细胞活力测定（52孔）吸弃缺血液，用PBS洗三次，每孔加110ULCCK8工作液，作用1H，用酶标仪在450NM波长处比色，测定吸光度。（11）免疫细胞化学技术（52孔）吸弃缺血液，PBS洗3次，甲醇固定5MIN；PBS洗3次，加入25L封闭液，37C培养30MIN；吸弃上清液，加一抗25L，37C培养2H后置于4C冰箱过夜；PBS洗3次，加入二抗25L，37C培养2H；PBS洗3次，加入25LSABC工作液（即用型），37C培养30MIN；PBS洗3次，用三蒸水稀释DAB显色液（20倍），混匀后每孔加入25L，镜下控制，细胞被染上色后，即以蒸馏水终止反应；吸弃上清液，加入适量蒸馏水，观察结果。五、预期结果1B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系一系列操作后，B基因表达产物被染为金棕色，通过比较颜色的深浅，我们可以知道B基因表达产物量的多少。如果总体而言缺血组颜色比空白组深，说明心肌细胞缺血过程中，B基因表达产物会增加，暗示了缺血损伤可能引发了B基因相关的凋亡通路，或者B基因表达产物会引发CASPASE级联反应；还有一种可能，B基因表达产物参加某种细胞内的自我保护机制，心肌细胞缺血后，这种保护措施被启动，B基因表达产物增加。如果缺血组总体而言，颜色比空白组浅，说明B基因表达产物在缺血损失时表达减少，则B基因有可能是一种抗凋亡、促进细胞存活的基因。而通过比较缺血2H、4H、6H组的颜色差异，可以观察B基因表达量随缺血损失时间的改变情况，应该会出现逐渐递增或递减的情况，也不排除在4H出现表达高峰或谷底的可能。2B基因的表达产物是否参与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程首先，通过比较吸光度的OD值，我们可以归纳出组间细胞活性的差异，OD值越大，细胞活性越大。可以预期的是，阴性对照组的细胞活性低于阳性对照组的细胞活性。分别比较加A药物20MOL/L、40MOL/L、60MOL/L组与阴性阳性对照组的OD值差异，我们可以判断在该种药物浓度的保护下，细胞是否得到了保护，保护效果及程度如何，活性是更接近于未加入保护的缺血细胞（即保护作用比较有限），还是更接近于未进行缺血损伤的阳性对照组（说明保护效果非常好）。通过比较三个加药组之间细胞活性的差异，我们可以分析哪种药物浓度具有最好的保护作用。其次，通过免疫细胞化学的显色结果，我们可以得出B基因表达产物是否有量的改变，进而得出B基因是否参与A药物对心肌细胞缺血的保护作用。如果缺血并给药组的细胞染色深浅介于阴性对照和阳性对照之间，则可以证明B基因表达产物在A药物保护心肌细胞免受缺血损失的过程中发生了量的变化，是参与其中的。而通过比较加A药物20MOL/L、40MOL/L、60MOL/L组之间细胞颜色的差异，再结合3者细胞活性的差异，则可以判断B基因的表达情况与保护效果的关系，如果细胞活性越高，B基因表达产物越多，说明B基因表达产物对A药物的保护起到辅助作用；反之，如果活性高的细胞所表达的B基因产物反而更少，说明B基因是一种促进凋亡的基因，A药物通过减少B基因表达产物的量来抑制相关凋亡通路，继而起到保护细胞缺血损失的作用。六、参考文献1钟理,宋治远模拟缺血再灌注