靶向性no供体型齐墩果酸衍生物的设计、合成和抗肝癌活性

目录中文摘要1英文摘要3第一部分研究背景7一、一氧化氮NO及NO供体型药物1、NO与肿瘤2、NO供体和NO供体型化合物的靶向策略3、NO供体型抗肿瘤药物4、NO供体与放疗、化疗或免疫疗法联合用药二、NO供体型抗肝癌药物研究的新思路第二部分目标化合物的设计一、3位呋咱氮氧化物修饰的齐墩果酸（OA）衍生物二、3位O2糖基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物三、3位O2乙烯基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物第三部分化学合成和讨论一、3位呋咱氮氧化物修饰的OA衍生物的合成与讨论二、3位O2糖基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物的合成与讨论三、3位O2乙烯基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物合成与讨论四、偶氮鎓二醇盐新的合成方法的探索及其讨论五、纳米TIO2催化NO和芳香伯胺的反应及其讨论第四部分生物活性研究一、3位呋咱氮氧化物修饰的OA衍生物的生物活性研究1、体外肿瘤细胞毒性试验2、活性化合物体内药效学研究3、活性化合物作用机理研究4、活性化合物的急性毒性研究5、关于药理结果的讨论二、3位O2糖基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物生物活性研究1体外肿瘤细胞毒性试验2活性化合物对正常肝细胞毒性试验3活性化合物NO释放试验三、3位O2乙烯基偶氮鎓二醇盐修饰的OA衍生物生物活性研究第五部分构量效关系探讨第六部分小结第七部分化学实验部分致谢参考文献靶向性NO供体型齐墩果酸衍生物设计、合成和抗肝癌活性博士生导师中文摘要一氧化氮（NO）具有“双刃剑”的作用特点。大量的研究表明，持续低浓度的NO可以促进细胞的生长，而高浓度的NO则诱导细胞凋亡。因此，调控外源性的NO供体靶向肿瘤细胞并释放高浓度的NO成为NO供体型抗肿瘤药物研究的关键。本论文内容主要分为两部分，一是研究靶向性NO供体型齐墩果酸衍生物的设计、合成和抗肝癌活性，二是研究具有靶向作用的NO供体偶氮鎓二醇盐NONOATES新的合成方法。一、靶向性NO供体型齐墩果酸衍生物的设计、合成和抗肝癌活性1、3位呋咱氮氧化物修饰的齐墩果酸衍生物基于肝癌细胞和正常肝细胞对肝毒物（包括药物）的代谢不同，考虑到肝病治疗药物齐墩果酸OA给药后主要在肝脏分布、代谢且具有抗肿瘤作用，同时考虑到NO在调节细胞凋亡时的双重作用,还考虑到一些肿瘤细胞比正常细胞对NO诱导的细胞凋亡更为敏感等特点，曾选择OA作为先导化合物，在其3位羟基连接呋咱氮氧化物NO供体，设计、合成了一系列化合物，研究目标物对肝的保护作用以及可能的抗肿瘤作用。发现其中化合物ZCVI4对肝癌细胞HEPG2和HEP3B显示了明显的细胞毒性。有趣的是ZCVI4并未诱导其它癌细胞如人前列腺癌细胞、人乳腺癌细胞、人宫颈上皮癌细胞的凋亡，对正常人肝细胞、人肾上皮细胞及小鼠淋巴细胞也无毒性作用，此结果提示，ZCVI4对肝肿瘤细胞具有特异性毒性作用。由于ZCVI4是一种水和乙醇中极难溶解的化合物，药理试验时须将其溶于DMSO再加适量缓冲剂PBS方能进行操作。曾试图通过各种物理方法，制备其微乳、纳米脂质体等口服或注射剂以符合将来临床用药的要求，均未能奏效。为了提高其水溶性和生物利用度，保持或者进一步增强其肝肿瘤细胞选择性，我们将ZCVI4分子结构中的羧基与葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等以酯键相连，制备了糖基衍生物（1426）。研究发现，半乳糖衍生物ZCVI4215在水中溶解度较ZCVI4有所改善，且显示了较强的体外抗肝肿瘤作用，对正常肝肿瘤细胞毒性较小；对人肝癌SMMC7721裸小鼠静脉给药25MG/KG,相对肿瘤增殖率T/C分别为441，而对照组5氟尿嘧啶（5FU）相同剂量给药,T/C为552，提示ZCVI42体内抗肝癌活性可能优于5FU；急性毒性试验结果表明，小鼠静脉注射ZCVI42的LD50为941MG/KG，为其有效剂量125MG/KG的75倍，显示了较高的安全性。研究还发现，ZCVI42在肝肿瘤细胞HEPG2中NO的释放量约是正常肝细胞LO2中的3倍,提示ZCVI42的肝肿瘤选择性可能与NO释放相关加入NO清除剂或将ZCVI42结构中的NO供体片段去除后,原有的抗肿瘤作用基本消失，证明了ZCVI42的抗肿瘤作用及其选择性与NO释放相关。进一步研究发现，ZCVI42通过至少是部分通过促细胞凋亡产生抑制肿瘤生长的效应；其作用机制可能是作用于凋亡相关的关键因子CASPASE3、BCL2以及BAX，从而激活凋亡通路，产生促凋亡效应。化合物ZCVI42作为新型的NO供体型抗肿瘤候选药物正在进行深入研究。2、3位O2糖基偶氮鎓二醇盐修饰的齐墩果酸衍生物偶氮鎓二醇盐NONOATES是一类重要的NO供体，它在生理条件下不稳定，极易释放NO，半衰期从几分钟到几小时不等。但是一旦将结构中的O2原子修饰后，就能形成稳定的前药，它在体内某些特定酶作用下，有可能靶向性地在肿瘤细胞释放NO,发挥抗肿瘤作用。为了进一步增强目标化合物的靶向性并改善其水溶性，我们将ZCVI42结构中的的呋咱氮氧化物片段替换成偶氮鎓二醇盐片段，并在OA的28位羧基上连接糖基以增加水溶性。在考虑偶氮鎓二醇盐的O2保护基时，我们选择了糖基保护，这是因为糖基化的偶氮鎓二醇盐在肿瘤细胞表面过度表达的单糖转运子的作用下，能特异性地转运至肿瘤细胞内，然后在糖苷酶的作用下释放NO；半乳糖等修饰后的产物有可能通过与肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体等作用，从而定向地转运到肝脏；另一方面，糖基对于水溶性贡献比较大，有利于后期的制剂研究。共设计合成19个目标化合物（2744），体外抗肿瘤活性筛选表明，化合物2729表现出较强的肝肿瘤细胞毒性作用，IC50值与ZCVI42相当，且对正常的肝细胞毒性较小。深入的药理研究正在进行中。3、3位O2乙烯基偶氮鎓二醇盐修饰的齐墩果酸衍生物已知乙烯基保护的偶氮鎓二醇盐盐能特异性地被肝脏P450酶活化，并释放出NO。研究表明，OA是正常肝细胞P450某些亚型的竞争性抑制剂，而对肝肿瘤细胞表达的P50亚型没有影响，提示肝癌细胞和正常肝细胞对OA或其衍生物的代谢可能不同。因此我们在OA的3位连接O2乙烯基保护的偶氮鎓二醇钠盐，同时考虑整个分子的水溶性，在OA的28位连接糖基，共合成目标化合物28个（4572）。设想它们可能在正常肝细胞释放少量NO，起到肝细保护作用,而在肝肿瘤细胞释放大量的NO，发挥细胞毒性作用。体外肝肿瘤细胞毒性筛选试验表明，化合物51较ZCVI42具有更强的抗肝肿瘤活性，进一步的药理研究正在进行中。二、靶向作用的NO供体偶氮鎓二醇盐新的合成方法在上述基于偶氮鎓二醇盐的OA衍生物设计、合成中，我们还面临一个关健问题如何方便、快捷地获得结构类型多样的偶氮鎓二醇盐已知文献制备条件相当苛刻，需要特殊的设备以及在低温、和/或高压下反应等。因而，发展新的方法来高效制备偶氮鎓二醇盐非常迫切且意义重大。考虑到纳米TIO2对气体小分子有一定的吸附和活化作用，我们首次将纳米TIO2引入到偶氮鎓二醇钠盐的制备过程中。发现将NO气体和脂肪仲胺经TIO2催化反应，在常温常压下可制备结构多样化的偶氮鎓二醇钠盐，且产率与文献报道相比有较大提高。当我们把此法推广到NO气体和芳香伯胺的反应时，却意外得到了另外一类重要的NO供体CUPFERRONS，而不是相应的偶氮鎓二醇钠盐。我们因此发展了一种全新的偶氮鎓二醇盐和CUPFERRONS制备方法，并提出了反应的可能机理。我们的研究不仅扩展了NO所参与的反应范畴，更为重要的是，还推动了靶向性NO供体型药物的研究。这一新方法的进一步应用还在探索中，我们将陆续报道其研究结果。关键词靶向性；一氧化氮供体；偶氮鎓二醇盐；齐墩果酸；抗肝癌药物STUDIESONDESIGN,SYNTHESISANDANTIHEPATOCELLULARCARCINOMAACTIVITYOFSITETARGETINGANDNODONATINGOLEANOLICACIDDERIVATIVESDISSERTATIONFORPHDDEGREECANDIDATECHENLISUPERVISORPROFYIHUAZHANG（未修改）ABSTRACTTHISDISSERTATIONISMAINLYDIVIDEDINTOTWOPARTSONEIS“DESIGN,SYNTHESISANDANTIHEPATOCELLULARCARCINOMAACTIVITYOFSITETARGETINGANDNITRICOXIDEDONATINGOLEANOLICACIDDERIVATIVES”,ANDTHEOTHERIS“ANOVELAPPROACHFORTHEPREPARATIONOFNODONORNONOATES”1、DESIGN,SYNTHESISANDANTIHEPATOCELLULARCARCINOMAACTIVITYOFSITETARGETINGANDNITRICOXIDEDONATINGOLEANOLICACIDDERIVATIVESNITRICOXIDENOENDOGENOUSLYPRODUCEDFROMLARGININEISINVOLVEDINNUMEROUSPHYSIOLOGICALANDPATHOLOGICALPROCESSESITISKNOWNTHATHIGHCONCENTRATIONSOFNOMAYBECYTOSTATICORCYTOTOXICTOTUMORCELLSLEADINGTOAPOPTOSIS,WHEREASRELATIVELYLOWLEVELSOFNOCANHAVEOPPOSITEEFFECTANDPROMOTETUMORGROWTHANDPROLIFERATIONSINCENOISAJANUSFACEDMOLECULE,THESELECTIVEDELIVERYOFEXOGENOUSNOTOTHESPECIFICTISSUESHASRECENTLYBEENATTRACTINGMUCHATTENTION,PARTICULARLYINTHEFIELDOFANTICANCERTHERAPYHOWEVER,TOTHEBESTOFOURKNOWLEDGETHEREAREFEWNODONORDRUGSWITHANTIHEPATOCELLULARCARCINOMAHCCACTIVITYNATURALPRODUCTOLEANOLICACIDOAISMAINLYDISTRIBUTEDANDMETABOLIZEDINTHELIVERANDHASBEENSHOWNTOPROTECTRODENTLIVERFROMCCL4ANDOTHERTOXICANTINDUCEDHEPATOTOXICITYANDCHRONICCIRRHOSISFURTHERMORE,ITHASBEENFOUNDTHATOAANDITSDERIVATIVEPOSSESSANTITUMORACTIVITYANDHAVEDIFFERENTMETABOLICBEHAVIORSINLIVERNORMALANDTUMORCELLSONTHEBASISOFRESEARCHMENTIONEDABOVE,WETRIEDTODEVELOPNOVELSITETARGETINGANDNODONATINGOADERIVATIVESWITHANTIHCCACTIVITYTHUS,FOURSERIALSOFCOMPOUNDSWEREDESIGNED,SYNTHESIZEDANDBIOLOGICALLYEVALUATEDFIRSTLY,ASERIALOFFUROXANBASEDNORELEASINGDERIVATIVESOFOAWEREDESIGNEDANDSYNTHESIZEDITWASFOUNDTHATCOMPOUNDZCVI4COULDSELECTIVELYPRODUCEHIGHLEVELOFNOINHUMANHCCCELLSFIGURE1,EXHIBITSELECTIVECYTOTOXICITYAGAINSTHCCWITHIC50005MINVITROFIGURE2ANDSIGNIFICANTLYINHIBITTHEGROWTHOFHCCTUMORSINVIVOSEEREF3INTHEPUBLICATIONLISTHOWEVER,THEAQUEOUSSOLUBILITYOFZCVI4ISSOPOORTHATATTEMPTSTOPREPAREITSINJECTIONSEVENUSINGMICROEMULSIONANDNANOLIPOSOMESMETHODSWERENOTSUCCESSFULSOTHENEXTWORKWASTOSYNTHESIZEGLYCOSYLDERIVATIVESOFZCVI4BYINCORPORATINGGYLCOSYLONTO28COOHOFZCVI4THROUGHANESTERLINKAGE,INTHEHOPETHATTHESEDERIVATIVESCOULDIMPROVETHEAQUEOUSSOLUBILITYANDMAINTAINTHESELECTIVEANTIHCCACTIVITYOFPARENTZCVI4AMONGTHESECOMPOUNDS,THEGALACTOSYLMODIFIEDDERIVATIVESZCVI42EXHIBITEDPOTENTSELECTIVEANTIHCCACTIVITYINVITROFIGURE3ANDINVIVOFIGURE4,IMPROVEDAQUEOUSSOLUBILITYANDPRESENTEDGOODSAFETYPROFILE,SUGGESTINGTHATITMAYBEAPROMISINGCANDIDATEFORTHETREATMENTOFHEPATOMASEEREF2INTHEPUBLICATIONLISTTHANKSTOTHERESULTSABOVE,OURPROJECTTITLED“THESTUDYOFNOVELANTILIVERCANCERCANDIDATEZCVI42”HASSUCCESSFULLYGOTTHEFINANCIALSUPPORTFROMTHEADMINISTRATIONOFNATIONALSCIENCEANDTECHNOLOGYWITHTHECONSIDERATIONTHATDIAZENIUMDIOLATENONOATESISANIMPORTANTTYPEOFNODONORSANDO2GLYCOSYLNONOATESPOSSESSSOMESITETARGETINGPROPERTY,WEREPLACEDFUROXANMOIETYINZCVI42WITHO2GLYCOSYLNONOATESTOGETANOTHERSERIALOFOADERIVATIVESPRELIMINARYRESULTSINVITROSCREENINGINDICATETHREEOFTHEMDISPLAYEDPOTENTANTIHCCACTIVITIESOTHERBIOLOGICALEVALUATIONINCLUDINGINVIVOASSESSMENTANDTHERELATIONSHIPBETWEENNOPRODUCTIONANDANTIHCCACTIVITYAREUNDERGOINGITWASREPORTEDTHATOAINHIBITSOMESUBTYPESOFCYTOCHROMEP450CYPEXPRESSEDINTHENORMALLIVERCELLSWITHOUTAFFECTINGTHEACTIVITYOFCYPSUBTYPESEXPRESSEDINTHEHEPATOMACELLSHEPG2ANDHEP3B,ANDTHATO2VINYLNONOATESCANBEACTIVATEDBYP450SWITHTHESEINMIND,WEHYPOTHESIZEDTHATTHEO2VINYLNONOATESBASEDOADERIVATIVESCOULDRELEASENOSLIGHTLYINTHENORMALLIVERCELLS,WHICHCOULDPRODUCEHEPATOCELLULARPROTECTIVEACTIVITY,WHEREASGENERATELARGEAMOUNTOFNOINHCCCELLS,WHICHCOULDINDUCECYTOTOXICITYANEWSERIALOFO2VINYLNONOATESBASEDOADERIVATIVESHASBEENDESIGNEDANDSYNTHESIZEDTHEBIOLOGICALEVALUATIONSAREINPROGRESS化合物51较ZCVI42具有更强的抗肝肿瘤活性，进一步的药理研究正在进行中。（结果等完全出来在做定夺）2、ANOVELAPPROACHFORTHEPREPARATIONOFNODONORNONOATESCURRENTACCESSOFNONOATESWASGENERALLYUNDERCONSIDERABLYSTRICTCONDITIONS,SUCHASSPECIALAPPARATUS,LOWTEMPERATURE,AND/ORHIGHPRESSUREWEFOUNDNOCANEASILYREACTWITHALIPHATICCYCLICAMINESATRTUNDERATMOSPHERICPRESSURETOOFFERNONOATESIFACTIVATEDONTHESURFACEOFNANOMETERSIZETITANIUMDIOXIDETIO2INTERESTINGLY,INEXPANDINGTHISNOVELANDFACILEAPPROACHTOAROMATICAMINESFORTHEPREPARATIONOFTHECORRESPONDINGNONOATES,CUPFERRONSWEREUNEXPECTEDLYOBTAINEDTOTHEBESTOFOURKNOWLEDGE,WEARETHEFIRSTTOREPORTTHENANOMETERSIZETIO2CATALYZEDREACTIONSOFNOWITHAROMATICPRIMARYAMINESTOFORMCUPFERRONSODIUMSALTSINONESTEPTHECORRESPONDINGMECHANISMSWEREALSOPROPOSEDFIGURE5SEEREF1INTHEPUBLICATIONLISTTHENOVELAPPROACHFORTHEPREPARATIONOFNONOATESANDCUPFERRONSHASOBTAINEDRECOGNITIONFROMTHEOTHERRESEARCHERSINNODONORFIELDPROFESSOREDWARDEKNAUSETALFROMTHEUNIVERSITYOFALBERTAINCANADAHIGHLYEVALUATEDITAS“ANOVELINVENTIONTHATWILLREVOLUTIONIZETHEFIELDOFSITETARGETINGNODONORDRUGS”第一部分研究背景肝癌是人类最致命的恶性肿瘤之一,全世界每年有50万患者死亡,死亡指数高达094。据报道,每年约有45新发病的肝癌病例在我国大陆,肝癌已成为我国第2位恶性肿瘤致死原因,其形势十分严峻1,2。长期以来，由于没有很有效的治疗药物，手术切除成为治疗肝癌肝移植除外的唯一有效方法3。但是，由于肝癌发病隐匿，一旦发现常常已经失去手术时机，因此肝癌的手术切除率还不到15，即使根治切除，复发率仍高达4060。对于那些不能进行手术的肝癌病人，药物治疗占有极其重要地位。随着科学的不断发展,人们一直在研究、开发新的抗肝癌药物,并已取得了相当的进步。然而，肝癌药物的治疗效果总体来说并不令人满意，一般中晚期肝癌患者的自然生存时间仅为个月。抗肝癌药物之所以如此,除治疗药物本身的药理作用尚不够理想外，主要是药物在肝脏特别是肝肿瘤细胞中分布较少，毒副反应较大，即药物的靶向作用差。抗肿瘤药的靶向作用是指药物针对某种癌细胞，或者是针对癌细胞的某一个蛋白、某一个分子进行治疗4。它分为三种不同层次，第一种是针对某个器官，例如某种药物只对某个器官的肿瘤有效，这叫器官靶向；第二种为细胞靶向，只针对某种类别的肿瘤细胞，药物进入体内后可选择性地与这类细胞特异性地结合，从而引起细胞凋亡；第三种是分子靶向，是指在肿瘤分子细胞生物学的基础上,利用肿瘤组织或细胞所具有的特异性结构分子作为靶点或者是一个核苷酸的片段，或者是一个基因产物,使用某些能与这些靶分子特异性结合的抗体、配体、酶抑制剂等,达到直接治疗或导向治疗的目的。近年来，在靶向性抗肝癌药物的研究方面取得了一定进展，主要从以下途径实现药物的肝靶向1去唾液酸糖蛋白受体介导将抗肿瘤药物与半乳糖化的大分子蛋白或化合物偶联,利用肝细胞表面特异性的去唾液酸糖蛋白受体的结合作用,将药物特异性转运到肝脏52免疫导向将抗肿瘤药物与肿瘤相关抗原的单克隆抗体相连接,通过抗原抗体结合的生物特异性相互作用,将药物定向输送至肝肿瘤部位63载体导入将抗肿瘤药物与脂质体、微球等肝靶向性载体结合，结合物选择性地到达肝脏，发挥药物作用7。上述三种肝靶向途径虽然在抗肝癌药物研究中取得了一定的进展，但仍然存在一些需要解决的难题。途径1和3能使药物靶向转运至肝脏，降低药物对其它组织的影响，但并不一定能特异性地将药物有效地输送至肝脏病变的精确部位，即特定的肿瘤细胞部位，故细胞靶向性较差，有可能对正常肝细胞也产生伤害。途径2虽能靶向作用于某些肝肿瘤细胞，但须要解决单克隆抗体人源化的问题而且此类药物一般稳定性较差，半衰期较短，难以释放足够量的药物到达肝癌细胞。因此,如何从上述三种不同层次上继续寻找高效、低毒的抗肝癌药物仍是一项极为紧迫而重要的全球性课题，任重而道远。一、一氧化氮NO及NO供体型药物20世纪90年代后，人们发现一氧化氮NO在医药方面具有巨大的潜力,NO作为信使物质或效应分子在体内发挥极其重要的生理功能，NO生成不足或NO信号传导异常与多种疾病的形成和发展密切相关，有关NO的研究逐渐成为生命科学和医药研究的热点和前沿之一。由于NO是一种多向性、多效性的分子，因而，靶向性释放NO到特定组织部位，已成为近年来关注和研究的热点，尤其是在NO型抗肿瘤药物的研究中8。以下对NO在抗肿瘤方面的有关背景如NO、NO供体与肿瘤、NO供体靶向策略及NO供体型抗肿瘤药物等方面作一简介。1、NO与肿瘤NO在肿瘤的发生、发展和死亡中的作用已成为肿瘤生物学研究的热点之一。大量的研究表明，持续低浓度的NO可以促进肿瘤细胞的生长，而高浓度的NO则产生抗肿瘤作用。NO抗瘤机制9主要有A通过上调P53、降解抗凋亡介质、诱导SMAC的释放以及增加细胞色素C释放等诱导肿瘤细胞凋亡；B通过阻滞细胞周期、减少血管生成、引起细胞坏死等来抑制肿瘤细胞增殖；C）阻止肿瘤转移等。研究还发现，一些肿瘤细胞较正常细胞对NO诱导的细胞凋亡更为敏感。据报道，NO供体（见下述）偶氮鎓二醇盐DIAZENIUMDIOLATE，NONOATE诱导人急性髓白血病AML细胞HL60凋亡的IC50值为0006MM,但在0205MM高浓度下却未对正常细胞产生任何毒性10。2、NO供体和NO供体型化合物的靶向策略NO供体是指在体内经酶或非酶作用释放NO的化合物，它可作为一种NO体内运输形式，又可作为一种贮存形式，延长NO半衰期。现已发现多种结构类型的NO供体，如偶氮鎓二醇盐、硝酸酯、亚硝基硫醇、呋咱N氧化物等，其中偶氮鎓二醇盐类在靶向性释放NO方面优势明显。偶氮鎓二醇盐在生理条件下不稳定，极易释放NO，半衰期从几分钟到几小时不等。但是一旦将O2原子与氮鎓离子相连的O称之为O1，与烯键氮原子相R1N2OORO2DERIVATIES2NOR1N2OR1NH2PH7437ENZYMENOATESCHEME1O2修饰的偶氮鎓二醇盐释放NO连的O为O2修饰后，就能形成稳定的前药，它在体内某些特定酶作用下，有可能选择性地在肿瘤细胞释放NOSCHEME1,发挥抗肿瘤作用。下面根据O2保护基的不同略举几例。1、O2糖基保护的偶氮鎓二醇盐前药WANG研究小组合成了糖基化的偶氮鎓二醇盐前药（13）11，它们比母体偶氮鎓二醇盐要稳定得多，而且能在糖苷酶的活化作用下释放NOSCHEME2，且具有广谱的肿瘤细胞毒性。ONOHHOH1ONOHHO2ONHOH3ONNGLYCOSIDASEONN2NOHOSCHEME2O2糖基保护的偶氮鎓二醇盐衍生物及其可能的释放NO的途径进一步研究12,13证明，半乳糖基化的偶氮鎓二醇盐1能在肿瘤细胞表面过度表达的单糖转运蛋白的作用下，特异性地转运至肿瘤细胞内，然后在半乳糖苷酶的活化作用下释放NO，提示这类前药是潜在的抗肿瘤药物。2O2乙烯基取代的偶氮鎓二醇盐前药美国国立癌症研究中（NCI）的KEEFER研究小组报道了肝脏选择性的NO供体前药化合物414能被肝脏中的P450家族特异性的代谢，具有很好的肝脏靶向性。研究显示，4能阻断肿瘤坏死因子诱导的肝脏细胞的凋亡和毒性14；能对抗镉对小鼠肝脏细胞的毒性和诱导凋亡15；能保护肝脏在器官移植中免受缺血再灌注损伤16；也能保护对乙酰氨基酚诱导的肝脏和肾脏毒性17。2007年KEEFER对4进行结构修饰改造，在N的位引入一个羧基，得到化合物5SCHEME318。这样做是基于以下几点考虑1）结构的类似性保证了5可能维持对肝脏选择性；2）羧基的引入，既可以增加水溶性，也为进一步与多肽、聚合物衍生创造了可能；3）4代谢释放NO的同时也释放吡咯烷，而5降解出NO的副产物是人体本身需要的氨基酸脯氨酸，理论上5的毒性可能小于4。因此，5具有较好的前景。NOCH5NO4NO4CYTOCHRMEP450NOHOEPOXIDEHYRLASNO2NOSCHEME3化合物4和5的结构以及化合物4的可能的释放NO的途径3O2芳基取代的偶氮鎓二醇盐2003年，KEEFER和犹他大学的SHAMI博士合作研究发现，O2芳基偶氮鎓二醇盐JSKSCHEME4可选择性地在急性髓白血病（AML）HL60细胞内释放NO，杀灭癌细胞，而不伤害正常细胞。其后又发现,对免疫缺陷型小鼠体内植入的HL60细胞及前列腺癌细胞PPC1，JSK均能抑制其生长,且不导致小鼠血压下降等副作用。进一步用60种不同癌细胞系（包括肝癌细胞系）对JSK进行研究，结果显示，JSK具有广泛的抗癌活性。现已证明，JSK系通过浓度和半胱氨酸蛋白水解酶（CASPASE）依赖模式诱导肿瘤细胞凋亡19。JSK的临床前研究得到NCI高度重视，被列入其快速研发的规划（RAID）中。如果说JSK作为抗癌新药引起人们高度关注的话，那么真正使人们产生更大兴趣的则是它的发现开辟了一条抗癌新途径。已知谷胱甘肽S转移酶GST是体内解毒的关键酶，在多种肿瘤细胞内过度表达。不少抗肿瘤药物在GST作用下与谷胱甘肽GSH结合，继而经多药耐药蛋白MRP介导被排出细胞，导致肿瘤细胞产生多药耐药性MDR20。此外，GST还可通过抑制丝裂原激活的蛋白激酶MAPK途径，产生肿瘤细胞的耐药性21。研究表明，JSK作为GST的底物，在GST催化下，与GSH进行反应如SCHEME4所示后释放NO22,23。所释放的NO除诱导肿瘤细胞凋亡外，还激活了MAPK家族中的成员如ERK，JNK和P38及其下游效应子CJUN和AP1。因此，JSK不仅抑制肿瘤的生长，而且还降低了肿瘤细胞对其它抗癌药如砷类和顺铂类药物的耐药性21。SCHEME4PROPOSEDMECHANISMBYWHICHJSKGENERATESNOBYGSH由于GST是一组多基因表达的蛋白酶，至少存在5种亚型，和，其中GST在人体多种肿瘤细胞（包括肝肿瘤细胞）内过度表达，与多药耐药性关系尤为密切24。因此，研究选择性作用于GST的药物对抗癌和逆转肿瘤多药耐药性可能更具有意义。然而分子模拟研究和NO释放试验发现，GST较GST更有利于与JSKGSH的复合物作用，换言之，JSK对GST具有较好的选择性22,23见FIGURE1。ONNN2NO2OETGSHMEISNHEIMRCOPLEXNNO2NSNHOOHOHN2OOOETJSKTSNHOOHOHN2NO2ONNOETPH742NONHOETNO2FIGURE1JSK与GST和GST结合的分子模拟图分子模拟结果提示，减小偶氮鎓二醇盐片段胺部分的位阻和提高芳香基片段的位阻都有利于增加对GST的选择性。因此，KEERFER等25合成了PABA/NO，分子模拟显示PABA/NO对GST有较好的选择性FIGURE2。进一步研究显示PABA/NO对人卵巢癌模型有较好的活性。深入研究正在进行中。FIGURE2PABA/NO的机构及其与GST和GST合的分子模拟图2008年KEEFER研究小组又分别报道了JSK和PABA/NO的结构类似物，并取得了一定的进展26,27。4O2酰氧甲基保护的偶氮鎓二醇盐据报道28,对酯酶敏感的O2乙酰氧甲基偶氮鎓二醇盐（6和7）在37,PH74的磷酸盐缓冲液中16H后几乎没有降解（其母体偶氮鎓二醇盐在相同条件下半衰期仅为2MIN和3S,但在猪的肝脏酯酶的作用下它们可迅速降解。ONON2O2NONHPAB/NONOCH2OACNOCH2OAC676OR7EATRSEPH74R2NONPH74HALFLIVESAT37R2NH2NOSCHEME5O2乙酰氧甲基保护的偶氮鎓二醇盐可能的代谢途径研究表明，6和7给药72H后,对NO敏感的人白血病细胞株HL60的IC50分别为83和64M,而其母体IC50600M对U937细胞，6和7的IC50为53M。当初始浓度为50M，经过24H的培养，6和7分别诱导50和57的HL60细胞，35和49的U937细胞凋亡。这些数据提示,O2经乙酰氧甲基保护的偶氮鎓二醇盐具有较好的体外抗白血病细胞活性。另一个成功的例子是利用小分子肽的羧基和O2氯甲基偶氮鎓二醇盐偶联。WANG研究小组设计、合成了一系列前列腺特异抗原底物类似物小分子肽SERSERTYRTYR，SERSERPHETYR以及GLYILESERSERPHETYR与偶氮鎓二醇盐的偶联物（810），它们能被糜蛋白酶或前列腺特异抗原所活化，进而靶向性地释放NO，达到杀灭前列腺癌细胞的目的29。HNOOACHNONHOOHOHNOHON8HNOOACHNONHOOHNOHOON9HNOONHONHOOHNOHOONOHNACHNO10ROONPROTEASRCO2ONOH2COON2NOSCHEME6小分子肽偶氮鎓二醇盐偶联物810的结构及其释放NO的机制3、NO供体型抗肿瘤药物NO供体型抗肿瘤药物一般是指NO供体通过连接基团与现有的抗肿瘤药物（或活性基团）结合而成的前体药物，在体内可以通过酶解作用，释放NO和原药，因此这类药物的抗肿瘤作用一般优于原药。例如，5氟脲嘧啶5FU与偶氮鎓二醇盐的偶联物11和12,SCHEME7对人宫颈上皮癌和前列腺癌细胞比5FU具有更强的细胞毒性30。HNFOOOOON1NFOOOOONNO12SCHEME75FU与偶氮鎓二醇盐的偶联物11和12的结构近年来最受人关注的NO供体型抗肿瘤药物是NO供体型非甾体抗炎药（NONSAIDS）。这类药物具有NSAIDS的抗炎、抗肿瘤作用，但无NSAIDS的胃肠道和心血管副作用，且体内外抗肿瘤活性显著优于NSAIDS。据报道，NO阿司匹林（SCHEME8）已进入临床研究,治疗结直肠癌31。NONSAIDS的抗癌机制包括阻断WNT信号通路、抑制NFB的激活、抑制INOS、调控COX2等32。OON2O13SCHEME8NO阿司匹林的结构4NO供体与放疗、化疗或免疫疗法联合用药已知实体瘤组织中缺氧可诱导因子1HIF1的聚集会导致癌症化疗、放疗或免疫疗法的耐受以及预后不良，以HIF1为靶点的抗癌药物研究被认为是一种新的癌症治疗策略。研究表明33，NO供体与化疗药物联用，通过形成过氧化亚硝酸盐损伤肿瘤DNA并激活P53，减少HIF1在缺氧癌细胞中的聚集，可克服对常规治疗剂的耐药性。例如,在一个II期临床试验中，NO供体硝酸甘油和长春瑞滨/顺铂联合治疗B或期非小细胞肺癌病人,与单用长春瑞滨或顺铂相比，治疗效果提高了7234。此外，NO供体作为放疗和免疫疗法的增敏剂也取得了很好的疗效9,33。此外，NO供体型抗肿瘤药物研究中的一些关键问题，如NO体内测定等也已取得了重要进展35。二、NO供体型抗肝癌药物研究的新思路近年来，本课题组对NO供体型抗肝癌药进行了初步的探索，并在此基础上提出新的NO靶向策略。我们将NO供体与对特定组织具有高度亲和力的载体或药物相连，生成物在体内靶向转运到该肿瘤组织，释放NO，诱导肿瘤细胞凋亡3639。现简介如下齐墩果酸OA为五环三萜类化合物，主要用于治疗肝炎、肝硬化等慢性肝脏疾病，在治疗剂量下未见其有明显副作用。研究发现，OA给药后主要在肝脏分布和代谢40。近年来国内外不少文献报道，OA能抑制肿瘤新生血管生成，阻止肿瘤细胞的侵袭和转移，显示了抗肿瘤作用41。HOOHOA328OA的保肝作用与一条抗毒素的代谢途径有关。肝脏是一个重要的代谢器官，它负责包括NO供体在内的多种化合物、毒物和药物的生物激活和失活。大多数的肝毒物需要代谢激活，特别是通过细胞色素P450CYP酶系统参与才能产生作用。OA已被证明可以竞争性抑制人类肝细胞中主要与肝毒物生物激活有关的CYP亚型CYP2E1、CYP1A2和CYP3A4的活性，但对其它CYP亚型没有抑制作用。有趣的是，人类肝细胞癌HCC细胞，如HEPG2和HEP3B等，主要表达对OA不敏感的CYP亚型CYP1A1、CYP1B1和CYP4B14244。HCC细胞和正常肝细胞内CYP亚型的不同表达,与HCC细胞其它特性一道,可能导致它们对NO供体型OA衍生物明显不同的代谢能力，生成数量不等的NO及其相关产物。因此，我们设想NO供体型OA衍生物在正常肝细胞中可能产生低浓度的NO，但在HCC细胞中可能通过不同的激活或失活代谢途径，产生高浓度的NO及其代谢物活性氮蔟RNS和活性氧蔟ROS。考虑到肝癌细胞和正常肝细胞对肝毒物（包括药物）的代谢不同同时考虑到NO在调节细胞凋亡时的双重作用,即低浓度的NO通常保护细胞不被凋亡,并且促进细胞的生长和分化,而高浓度的NO具有细胞毒性，能够诱导细胞凋亡；还考虑到一些肿瘤细胞比正常细胞对NO诱导的细胞凋亡更为敏感等特点，本项目组曾选择OA作为先导化合物，在其3位羟基和/或28位羧基，通过连接NO供体，设计、合成了100多个结构类型新颖、释放NO机制多样化的NO供体型OA衍生物，目的是考察和控制NO靶向释放的部位、释放速率和释放量，研究目标物对肝保护作用以及可能的抗肝肿瘤作用。研究结果表明，所合成的NO供体型OA衍生物由于应用的NO供体及连接基团不同，在NO释放部位和释放量方面有所差异。一些衍生物在肝脏细胞内释放少量NO，表现出抑制细胞凋亡、保护肝脏的作用，如化合物II2，见SCHEME939；另一些衍生物能选择性地在肝肿瘤细胞内释放较大量的NO，诱导肿瘤细胞凋亡，不伤害正常肝细胞,显示了特异性的肝肿瘤细胞毒性作用，其中化合物ZCVI4活性最强SCHEME9，FIGURE336。R1OCOR2H3COCHCOH23ON2I2R1CF3O,R2ZCVI4R1NOC6H5S2OCH2OCH2CO3,R2HSCHEME9II2和ZCVI4的结构FIGURE3ZCVI4诱导HEPG2和HEPG3B的凋亡ZCVI4在体外诱导肝癌细胞HEPG2和HEP3B的凋亡。有趣的是ZCVI4并未诱导其它癌细胞如人前列腺癌细胞、人乳腺癌细胞、人宫颈上皮癌细胞的凋亡，对正常人肝细胞、人肾上皮细胞FIGURE4及对小鼠淋巴细胞也无毒性作用，此结果提示,ZCVI4对肝肿瘤细胞有特异性毒性作用。KINETICSOFZCVI4INDUCINGCYTOTXICITY02040608010120061218TIMEHOURCYTOTXICITYHEPG2HEP3BCYTOTXICITYOFZCVI4ONHEPG2CELS0204060801012011098765CONCENTRATIONSLGMSPECIFCYTOTXICITYZCVI4OANCX100对荷瘤的NOD/SCID小鼠IP注射ZCVI415MGKG1,发现明显抑制肿瘤生长,在肿瘤细胞HEP3B植入后35天,抑瘤率达65FIGURE4。对给予ZCVI4的小鼠肝脏进行组织学检查，结果与对照组比较，没有发现显著差异。ZCVI4连续3天对小鼠IP给药15,50MGKG1DAY1，与OA给药组对照,在15天观察期内,未见小鼠死亡，其体重及行为正常,组织学检查也未见ZCVI4对小鼠肝脏有伤害作用。FIGURE4ZCVI4对肝肿瘤细胞的特异性毒性为了研究NO释放与活性之间的关系,又进行了NO释放测定。结果发现,具有细胞毒性的化合物释放较大量NO,与此形成鲜明对比,具有肝细胞保护作用的化合物释放较少量的NO（FIGURE5）。研究还表明，ZCVI4主要是在肿瘤细胞中释放高浓度的NO，诱导肝癌细胞凋亡，产生细胞毒性。进一步的研究表明，ZCVI4在肿瘤细胞中释放的NO比在正常肝细胞中约多3倍FIGURE5。实验结果进一步验证了NO在调节细胞凋亡中的双重作用，并初步解释了ZCVI4对肝肿瘤细胞的特异性毒性，深入的机制研究正在进行中。FIGURE5ZCVI4及II2细胞内NO释放情况第二部分目标化合物的设计本课题组近年来致力于治疗重大疾病的NO供体型药物研究，已取得一定的进展3639。如何提高此类药物的NO靶向释放性、组织特异性和改善生物利用度等一直是我们研究的关键问题。基于文献报道和本课题组先前的研究结果，本论文拟进一步以天然药物OA为先导物，设计、合成靶向性较强、水溶性较好的NO供体型OA衍生物。设想这类药物具有三种不同层次靶向性第一是器官靶向，即药物主要在肝脏中分布、代谢；第二为细胞靶向，经肿瘤细胞内高度或过度表达的酶或特定因子的作用，药物能选择性地在肝肿瘤细胞释放高浓度的NO；第三是分子靶向，所释放的NO通过前述的分子作用机制，如激活CASPASE、造成P53的快速累积和BCLXL的表达下调等，诱导肝肿瘤细胞凋亡。因此，在本论文第一部分，一方面对活性化合物ZCVI4进行结构改造，在OA的28位进行糖基衍生化；另一方面将不同保护的偶氮鎓二醇盐NO供体通过连接基团分别偶联到OA的3位羟基上，并在28位羧基上连接水溶性的基团。共设计、合成三大系列60个NO供体型OA衍生物。现分别介绍如下一、3位呋咱氮氧化物修饰的齐墩果酸衍生物前已述及，NO供体型OA衍生物ZCVI4能特异性地诱导肝肿瘤细胞（HEPG2、HEPG3）凋亡，而对正常的肝细胞和其他肿瘤细胞没有毒性作用，显示了较好的肝肿瘤细胞选择性，是一个有前景的苗头化合物。然而进一步的研究表明,ZCVI4是一种水和乙醇极难溶解的化合物，药理试验时须将其溶于DMSO再加适量缓冲剂PBS方能进行操作。曾试图通过各种物理方法，制备其微乳、纳米脂质体等口服或注射剂,以符合将来临床用药的要求，但均未能奏效。因此，有必要对ZCVI4进行结构修饰和改造，改善其水溶性的同时保留其较好的抗肿瘤活性。肝脏主要的3种细胞肝实质细胞、KUPFFER细胞、内皮细胞具有特殊的识别受体，即去唾液酸糖蛋白受体ASIALOGLYCOPROTEINRECEPTOR，ASGPR、甘露糖受体MANNOSESPECIFICRECEPTOR和磷脂酰丝氨酸受体PHOSPHATIDYLSERINERECEPTOR。其中，ASGPR是一种专一性识别末端含有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白。甘露糖受体是一种由巨噬细胞表达的识别受体，它存在于肝非实质细胞膜上45。因此，可将药物或活性化合物经半乳糖糖基化或甘露糖糖基化等修饰,制成基于ASGPR或甘露糖受体介导的肝靶向前体药物。另据报道,肿瘤细胞内过度表达糖跨膜转运蛋白GLUTS,GLUTS能促进单糖在哺乳细胞内转运。一些糖基化修饰的NO供体能选择性浓集于肿瘤细胞内,由糖苷酶活化后释放NO,发挥抗肿瘤作用4648,11。故此，针对ZCVI4水溶性差、生物利用度不高的缺点,设计、合成其OA28位糖基化的衍生物,以期在提高水溶性的同时，保留其成药的可能性，并进一步增强其靶向性。该系列共合成13个目标化合物（1426），包括己糖衍生物（1419，25和26），五碳糖衍生物（20，21）和二元糖衍生物（2224），结构通式见SCHEME10。OR43HO2R15O14R1OH,R2H,R3H,R4H,R5CH2O5,O,161,2,3O,4,57RNHCO3,R2H,R3H,R4H,R5CH2O181,R2,4,5C2O9,3,O,28OOONOPHS2ZCVI4H283R31R42OH201OH,2H,R3OH,R4H,O,O28OR21HOHOOH12R1,R2,13OH,H,241,2O,1O2825R1OH,R2H6,OOR21HOHNHH28SCHEME103位呋咱氮氧化物修饰的齐墩果酸衍生物1426为了考察活性化物15（ZCVI42）的药效部位以及NO对活性的影响，也合成了化合物15的NO供体片段96，和OA衍生物片段44。（见生物活性研究部分，P54，FIGURE16A）OOONOPHS215/ZCVI42OHHNOPHS2OH96OOOH4OOHHSCHEME11化合物15的以及其NO供体片段96和OA片段44的结构二、3位O2糖基偶氮鎓二醇盐修饰的齐墩果酸衍生物针对ZCVI4水溶性差，且其NO供体片段呋咱氮氧化物的靶向性不及偶氮鎓二醇盐，故对ZCVI4进行结构改造，用偶氮鎓二醇盐替换呋咱氮氧化物，并在OA的28位羧基上进行糖基衍生化，以增加整体分子的水溶性。在考虑偶氮鎓二醇盐的O2保护基时选择了糖基保护，这是因为前已述及糖基保护的偶氮鎓二醇盐能在肿瘤细胞表面过度表达的单糖转运蛋白的作用下，能特异性地转运至肿瘤细胞内，然后在糖苷酶的作用下释放NO12,13；半乳糖等修饰后的产物有可能通过与肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体ASGPR,其与糖结合的特异性关键在于半乳糖基，故又称之为半乳糖特异性受体等作用，从而定向地转运到肝脏45；另一方面，糖基对于水溶性贡献比较大，有利于后期的制剂研究。这一系列共合成18个目标化合物（2744），结构通式见SCHEME12OOOOR3OHHH4OR1HOHH2NO27R1,R2H,R3OH,R4H28R1OH,R2H,R3H,R4OH9H,O,30,O,OOOOR3OHHH431R1OH,R2H,R3OH,R4H32R1OH,R2H,R3H,R4OH,O,4,O,NOR1HOHH2NOOOOR3OHHH435R1OH,R2H,R3H,R4H36R1OH,R2H,R3H,R4OH7,O,O,8,O,OR1HOHH2NOOOONOR3OHHH439R1OH,R2H,R3H,R4H40R1OH,R2H,R3H,R4OH4,O,O,2,O,OR1HOHHR2NOSCHEME123位O2糖基偶氮鎓二醇盐修饰的齐墩果酸衍生物2742为了验证NO供体片段对活性的贡献，也合成了化合物34的O2糖基偶氮鎓二醇盐片段43和OA片段44，SCHEME13，（见生物活性研究部分，P71，TABLE21）。NCH22OHOHOHHNOOOOHOOHHH434SCHEME13化合物34结构中呋咱氮氧化物片段43和OA