人内皮细胞型一氧化氮合成酶（henos）第7外显子glu298asp（894g→t）单核苷酸多态性与糖尿病肾病相关性研究

人内皮细胞型一氧化氮合成酶（HENOS）第7外显子GLU298ASP（894GT）单核苷酸多态性与糖尿病肾病相关性研究青岛大学硕士学位论文人内皮细胞型一氧化氮合成酶（HENOS）第7外显子GLU298ASP（894GT）单核苷酸多态性与糖尿病肾病相关性研究姓名王忠超申请学位级别硕士专业内分泌学指导教师苗志敏20040301Y618136中文摘要894GT单核苷酸多态性与糖尿病肾病相关性研究中文摘要目的探讨北方地区汉族人内皮细胞型一氧化氮合成酶HENOS第7外显子II对238方法本研究应用聚合酶链反应，琼脂糖凝胶电泳和限制性内切酶BAN进行分析，其中2型糖尿病患者138例，根据尿微量白蛋白排泄率UAER的结果以及糖尿病肾病诊断标准将2型糖尿病人分为2个亚组糖尿病肾病组DN组，6L例、糖尿病非肾病组DN一组，77例同时选择同地区年龄以及性别相近的健康人为正常对照组CON组，100例。采用高浓度琼脂糖凝胶电泳分离技术，应用卡方检验比较各组间的等位基因和基因型频率，以及根据糖尿病患者的有关临床生化指标，应用LOGISTIC多元逐步回归分析此临床生化指标、等位基因以及基因型与糖尿病肾病的相关性。程、糖化血红蛋白以及空腹血糖。患者糖尿病肾病的发生有关，该多态性是糖尿病肾病的单核苷酸多态性并可作为遗独立危险因素。关键词2型糖尿病；人内皮细胞型氧化氮合成酶基因；单核苷酸多态性糖尿病肾病尿微量白蛋白排泄率。中文摘要研究生王忠超内分泌导师苗志敏教授墨苎塑量LIBETWEENOFTHEREATIONSHTHEPSTUDYOFTHEHUMANAT7NUCIEOTIDEEXONPOIYMORPHISIMSSINGIEANDCE|LNITRICOXIDEENDOTHEIIATDJABETICNEPHROPATHYABSTRACTSTOTHEBETWEENTHERELATIONSHIPOBJECTIVEINVESTIGATEEXON7OFLNITRICNUCLEOTIDEATTHEHUMANENDOTHELIALCELSINGLEPOLYMERPHISMOXIDEANDDIABETICINNORTHERNHANNEPHROPATHYPATIENTSSYNTHASEHENOSGENE2WITHDIABETESMOLLITUSTYPEMETHODSTHEANDAT7OFTHEGLU298ASP894GTALLELEEXONHUMANGENOTYPEENDOTHELIALCELLNITRICOXIDEIN238WERESYNTHASEHENOSGENESUBJECTSEXAMINEDCHAINBYANDPOLYMERASEREACTION，AGAROSEGELELECTROPHORESISRESTRICTIONWHICHTHEREWERE2138CASESOFDIABETESENZYMEBANII，OFTYPEMELLITUSAND100NORMALOFENTS2DIABETICWASSUBJECTSTHEGROUPPATJTYPEDERIDEDINTOTWOCASESSUBGROUPSDIABETICNEPHROPATHYGROUPDNGROUP，6LANDDIABETICTONONNEPHROPATHYCASESACCORDINGGROUPDNGROUP。77URINARYALBUMINEXECRETIONALLELEANDEACHWERERATEUAERTHEGENOTYPEAMONGGROUPWITHCONCENTRATIONCOMPAREDHIGHERAGAROSEGELELECTROPHORESISACCORDINGC1TOTHEINICALBIOCHEMICALRESULTSOFDIABETICRELATPATIENTS，THEJOSHIPTHECLBETWEENINICALDNBIOCHEMICALANDWASRESULTS，ALLELE，GENOTYPEINVESTIGATEDBYLOGISTICANALYSISTHEOFTRWSUITSBOTHALLELEANDTGWEREFREQUENCIESGENETYPEINTHANTHOSEINANDNORMALHIGHERDNGROUPDNGROUPWASNOTHEREDIFFERENCEBETWEENDNANDNORMAISIGNIFICANTSUBJECTSSHOWEDPO05STATISTICSTHATALLELETANDTGWEREANALYSISGENOTYPEASSOCIATEDWITHDIABETICIN2DIABETICANDNEPHROPATHYTYPEPATIENTSPO022THATTHELOGISTICREGRESSION0020，RESPECTIVELYANDANALYSISSUGGESTEDNUCLEOTIDEAT7OFEXONHENOSGLU298ASP894GTSINGLEPOLYMORPHISIMSGENEBERISKFACTORFORDIABETICA1LNDEPENDENTMAY英文摘要THETGTHISTHATOFCONCIUSIONFINDINGSSUGGESTEDGENOTYPEBENUCLEOTIDEOFHENOSASSOCIATEDWITHGENEMAYPOLYMORPHISMTSINGLEDIABETICINNORTERNHANWITH21ITUSDIABETESMELNEPHROPATHYPATIENTSTYPEANITBERISKFACTORFORCANDIABETICANDMAYINDEPENDENTBENEPHROPATHYSERVEDASANINHERITEDMARKEROFOFDNSUSCEPTIBILITY2DIABETESMEIIIIAICEIKEYITUSHUMANENDOTHEINITRICOXIDEWORDSTYPENUCIEOTIDESYNTHASEGENEHENOSSINGIESMSNPDIABETICPOIYMORPHIIAIINBUMEXECRETIONRATENEPHROPATHYDNURNARYPOSTGRADUATEWANGDIRECTEDZHIMINBYMIAO2，JI一894G,T单核苷酸多态性与糖尿病肾病相关性初步研究1引言糖尿病肾病DN是最常见的糖屎病微血管并发症之一。众多临床研究表明高血糖是发生DN的必要因素，但不是唯一因素。流行病学调查显示DN的发生均有家族集聚现象“3，不同种族DN发病率也有差异。1。大多数学者认为，T2DM是一种复杂的多基因疾病，表现为遗传基因多态性，但是迄今何为2型糖尿病肾病的易感基因目前仍无定论，DN的发生可能是由多个不同的易感基因与环境因素共同作用的结果。关于DN遗传易感性的研究正深入的进行，目前已经发现与2型糖尿病肾病相关的基因变异约有几十种，涉及糖代谢及其他各可能的病理生理环节。一氧化氮NO是一种重要的血管源性细胞因子，在维持内皮依赖性血管舒张、调节肾脏微循环、维持基础血压以及抑制肾小球系膜细胞增生中起关键作用，另外，尚有抗血小板聚集以及黏附作用。N0在DM早期的生成增加，活性增强，参与了肾小球高滤过机制，并增加了大分子通透性嘲；DM中晚期肾脏的N0生成明显下降，通过血流动力学和代谢等方面影响肾脏的微血管床，加速了肾小球基底膜和系膜基质增生，并导致肾小球血管壁结构和功髓紊乱嘲。HENOS是合成一氧化氮的关键酶，该酶的结构和或活性异常通过影响N0生成，参与糖尿瘸微血管并发症的发生和发展。目前已经发现多种HENOS基因多态可能与究表明，HENOS基因编码的298位氨基酸并不位于酶的催化位点或辅助因子结合域，是位于其结构的延伸部分“，GLU298ASP变异使酶的结构更为紧密，从而影响了酶的一级和二级结构导致酶活性改变，使NO的生成减少“”。最近的研究表明GLU298ASP变异与冠状动脉性疾病“”、急性心肌梗塞、原发性高血压”1、冠状动脉粥样硬化变异与糖尿病肾病的相关性无统计学意义，但NEUGEBAUER。1等对日本人调查研究表明，2型糖尿病患者伴肾病与无肾病相比，二者基因型分布明显不同，NOIRI”“研究认为GLU298ASP变异是终末期肾衰尤其是糖尿病肾病肾衰的预示因素。鉴于以上不同的报道，本研究对138例青岛地区汉族2型糖尿病患者进行了人内皮细胞型氧资料与方法率分析，旨在探讨该位点单核苷酸多态性与2型糖尿病患者DN的关系。2资料与方法21研究对象及分组211糖尿病组其中男67例，女71例平均年龄5929928岁，均为我院内分泌科住院和门诊患者。6个月内连续两次测定尿微量白蛋白排泄率UAER，根据UAER结果将2型糖尿病人分为2个亚组岁，UAER20200MIN。854岁，AER20PGMIN。研究对象均为本院内分泌病房和门诊就诊和治疗的汉族人，受检者之阊无血缘关系，经询问病史、查体和必要化验排除其他引起蛋白尿疾病。212正常对照组型糖尿病患者相匹配。研究对象均为从本院健康查体中心筛查出的健康成人，经检查除外糖尿病、冠心病、高血压病、高脂血症、痛风以及肾脏疾病。22标本采集和保存221所有受检对象均于隔夜抽空腹血，采集肘静脉血6ML。2211取已经消毒的5ML3M1全血，颠倒混匀，一700C冰箱保存，以备提取DNA行基因多态性分析。2212TG、总胆固醇0C、尿素氮、肌酐、谷丙转氮酶、谷草转氨酶以及尿酸。2资料与方法2213留取IML全血，用50ULEDTA抗凝，混匀，测定HHAIC。222所有的糖尿病患者，留取空腹8H以上的上午6OO至第二天上午6ML，置00共24小时总尿样，二甲苯防腐，测定总量记录，混匀后取10于15ML离心管中，一70“3冰箱保存，待测尿微量白蛋白。223所有的标本统一编号保存。各项指标均统一标准，一批完成测定。23实验仪器1台式离心机上海手术器械厂800型Q台式高速离心机上海安亭科学仪器厂TGL1613型0低温高速离心机美国BECKMAN和SIGMA冰箱4，一20和超低温一700C冰箱日本SANYO恒温水浴箱上海跃进医疗器械厂旋涡混合器上海医科大学仪器厂XW一804HYBAIDUSPCR扩增仪THERO电泳仪美国BIORAD水平电泳螬北京六仪嚣厂DYYIIL31BH岱0N紫外投射仪WP一92一L型NDFM一96型10管放射免疫计数器N微量移液器德国BRAND和EPPENDORFFAEL00N电子称量仪METTLERN控温烘干箱潍坊医疗器械厂KWI型0电热磁力搅拌器深圳天南海北有限公司N实验室常用的玻璃仪器N全自动生化分析仪日立公司产品7170型N紫外光光度分析仪电化学发光仪德国ROCHE2010ELECSYSN但，”动勖幻力的町螂糖化血红蛋白测定仪BIORAD公司DIASTAT24实验试剂室温20一250C存放，上海SBS赛百胜公司产品。葡萄糖1479，加蒸馏水至LOOML，高压灭菌后4“C冰箱储存备用。资料与方法3异丙醇4无水乙醇LIFE5引物一对由INVITROGENTECHNOLOGIES公司合成，溶解并稀释至LO“MOLL，置于一200C冰箱储存备用。25MM，置于一200C冰箱储存备用，PROMEGA公司产品。DNAINBUFFERB浓度DNA聚合酶TAQPOLYMERASESTORAGE7TAQ5UPL，置于一200C冰箱储存，PR叫EGA公司产品。8MGCLZ溶液MAGNESIUMX10DNA910BUFFERLOONFLIKCL100【LMPCRTAQPOLYMERASETRISHCLPH9，AT25，1TRITONX100，PROMEGA公司产品10去核酸酶水心UCLEASEFREEWATERLOOML，室温20一25存放PROMEGA公司产品。EDTANAPH80220ML，加蒸馏水至1000ML。12琼脂糖凝胶AGAROSEPROMEGA公司产品136XLOADING14溴化乙锭EB染液LOMGML15限制性内切酶BANPR觚GA公司产品。16RE10XBUFFER60MMTRISCLPH75，1MMNACI，60MMMGCL2，LOMMDTT，PROMEG公司产品。17ACETYLATEDBSALOUUL，PROMEGA公司产品。18限制性内切酶BAN大连宝生物工程有限公司产品。1910HBUFFER500ULLOMMTRISCLPH75，LOOMMKCL，01MMEDNA，1枷DT。001BSA，015TRITONX一100，50GLYCER01置于一200C冰箱储存，大连宝生物工程有限公司产品。20LOXLOADINGMGCLLOMM司产品。21尿微量白蛋白放射免疫分析试剂盒3X100管ALB标准品S,S。4资料与方法CV15，置于4。C冰箱储存，北京北方生物技术研究所产品。22尿素氮，肌酐，谷丙转氨酶，谷草转氨酶，谷氨酰转肽酶以及尿酸测定试剂美国BECKMAN公司产品。23葡萄糖测定试剂美国BECKMAN公司产品，批间差异62批内差异36。24胆固醇测定试剂美国BECKMAN公司产品，批间差异21，批内差异16。25甘油三酯测定试剂美国BECKMAN公司产品，批间差异2，2，批内差异15。26胰岛素测定试剂美国ROCHE公司产品，批间差异21，批内差异1麟，DNA27核酸分子量标准100BP低温保存，PROMEGA公司产品。25实验方法251L临床以及生化指标1所有研究对象均行身高、体重、血压测量，计算体重指数BMI体重身高2。2血浆葡萄糖测定用氧化酶法。3HPLC法测定糖化血红蛋白。4电化学发光法测定空腹胰岛素。5甘油三酯TG、总胆固醇TC、尿素氮、肌酐，谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转觚酶以及尿酸测定用CHODPAP法。6尿微量白蛋白排泄率UAER检测放免法A尿样处理超低温冰箱取出，静置半小时，充分混匀，编号样品管待测。B试剂重配各标准品分剐准确加入O5ML缓冲液溶解，溶解15分钟后摇匀“JIALB标记物用LOML缓冲液溶解；兔抗ALB抗体用105ML缓冲液溶解驴抗兔免疫分离刘充分混匀。E加样NSB管和0管分别加入缓冲液250和50UL，6个标资料与方法ALB，标准品，各样品管加入50UL样品设定准管各加入50UL抗体液LOOUL，旋涡混合器充分混匀；除去总T管和NSB管其余各管加入兔抗一ALB抗体200UL。混匀。D水浴将各管同时放入恒温水浴箱，预先设定温度37，温育30分钟。E加分离剂除外总T管快速准确向其余各管加入500UL驴抗兔免疫分离剂，混匀，室温放覆15分钟。F离心分离各管同时置于低温高速离心机，以3500转分离心15分钟，吸取上清。G测定每次10管，DFM一96型LO管放射免疫计数器测定各沉淀管的放射性记数C踟。最后根据24小时的尿量以及白蛋白含量计算出24小时尿白蛋白排泄率。252提取外周血白细胞基因组INA提取基因组DNA。具体步骤如下合。2室温下放置3分钟5，000RPM离心3秒，收集沉淀。3用LMLGN结合液悬浮，摇匀，5，000RPM离心3秒，收集沉淀。4用05ML漂洗液洗两次以及IML无水乙醇洗一次混匀，5，000RPM离心3秒，收集沉淀。5用08ML无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱，12，000RPM离心30秒，倒掉废物收集管里的乙醇，再离心1分钟，尽量除去无水乙醇。ULTE缓冲6将纯化柱套入一个干净的2OML的离心管中，加入100液于纯化树脂上不链粘在管壁上，室温下放置3分钟，12，000RPM离心2分钟。7重复6步骤一次。8离心管中收集到的液体既是冼脱下来的基因组DNA，取40UL电泳2琼脂糖，I20V，TO分钟捡测。253吸收光谱法测定ON浓度和纯度以及ON的保存I吸收光谱法测定DNA浓度在比色杯中加入LMLTE缓冲液，放入6资料与方法分光光度计中读取325NM数值，并将仪器调零取空自杯，放入含有DNA样品定OD值OD230OD260，OD260OD280比值在L820，表明质量较好的DNAUGLML0D260002。使用时反复的冻融会使DNA分子的断裂，4。C存放可以避免这一点，但是同时可能有些样品会因为各种原因降解，因此将DNA分装成数份，近期使用的存放于40C，长期备存则存放于一200C或一700C。254HENOS基因第七外显子894GT多态的检测T位点的基因片段引扬序列上游引物5AAGGCAGGACAGTGGATGGA一3下游引物5_CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA一38在200UL的薄壁反应管中，按照25UI的反应体系，依次加入下列各组分去核酸酶水118PLLOXBUFFER25虬15PLMGCI25MM4DNTP25MG20儿上游引物5PMOLL15乩L5PL下游引物5PMOLLDNA聚合酶5UL0，2PLTAQ2，OPL模板DNAB吹打后轻弹管壁混匀，L，000RPM瞬时离心。C按照如下的程序进行PCR的扩增94。C预变性5分钟，94变性30秒60退火30秒720C延伸45秒循环35次以后于72终延伸5分钟。225琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物取PCR扩增产物4UL，按照4LVV与6XBUFFER混合后，上LOADING资料与方法样子25琼脂糖凝胶舍有05UGMLEB，05TBE中120V电压恒流电泳30分钟，于紫外投射仪下观察结果。用DNAMARKER做对照，可以观测到扩增片段长度为248BP。见附图13BANII限制性酶切A取200UL的薄壁反应管，在20UL的反应体系中，依次加入下列各组分103PL去核酸酶水RELOBUFFER20虬BSA10UGUL02儿BANII10UUL05虬7OWLPCR反应产物待分离。23琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物取酶切产物LOUL，按照5LVV与6LOADINGBUFFER混合以后，上样于X3琼脂糖凝胶含有05UGMLEB，O5TBE中80V电压恒流电泳60分钟，05溴化乙锭染色LOMIN，于紫外投射仪下观察结果，用DNAMARKER做对照，可以观测到扩增片段长度有248BP、163BP、85BP。见附图126统计学处理正态分布计量资料用XS表示，两组间比较用T检验。运用HARDYWEINBERG检验确认标本的群体代表性，基因计数法计算各组基因型频率及等位基因频率，基因型频率及等位基因频率比较用X2检验。用LOGISTIC多元逐步回归分析尿微量白蛋白排泄率UAER与各临床资料以及人内皮细胞型一氧化氮合成酶各基因型或等位基因与糖尿病肾病的相关性用相对危险度表示。所有数据用SPSSL15统计软件处理。结果3结果31患者一般临床及实验室资科糖尿病组与正常对照组的空腹血糖、甘油三酯有显著性差异PO05年龄、体重指数、肌酐、甘油三酯、转氨酶以及尿酸等无显著性差异。依据尿微量白蛋白排泄率UAER将糖尿病组分为两个亚组ON组和DN一组，两亚组间性别构成无统组间临床生化资料差异均无显著性差异PO05，见附表1、2。32型频率分布情况PCR产物以及BAN种片段。酶切以后仅见248BP片段为含突变等位基因的纯台予基因型TT少，正常组和糖尿病肾病组各测得1例和2佣；完全酶切得到大小为163BP和85BP两个片段的是段的为杂合子基因型TG。由此记数出8946T等位基因和基因型频率分布情况。见附表3、5。33各组等位基因频率和基因型频率的分析预期值差异无显著性，符合HARDYWEINBERG遗传平衡定律。见附表7、825257X2分析显示，与DN一组相比，DN组TG基因型分布频率显著升高XTG基因型以及T等位基因分布频率升高更为显著，X2分别为13499、14，749，OR较，TG基因型以及T等位基因分布频率无明显的差异PO05。34糖尿病肾病各危险因素与糖尿病肾病相关性的分析9讨论糖尿病肾病各危险因素LOGISTIC逐步回归分析选择年龄、性别、病程、体重指数、收缩压、舒张压、空腹血糖、糖化血红蛋白、空腹胰岛素、甘油三脂、总胆信区间为107797见附表9。4讨论一氧化氮N0是一重要的血管源性细胞因子，在维持基础血压、内皮依赖性血管舒张和调节肾脏微循环以及抑制肾小球系膜细胞增生中起关键作用”，此外NOHENOS尚有抗血小板聚集以及黏附作用。研究显示，N0的异常与糖尿病肾病有关TOO是合成NO的关键酶，该酶的异常可以通过影响N0的生成参与糖尿病肾病的发生和发展。SCHIMASAKI成减少。日本的研究“”结果表明2銎糖尿病患者伴肾病与无肾病相比，二者的基因型分布明显不同。本研究涉及HENOS第7外显子基因中248对碱基。野生型有个BANII作用位G后则为纯合子变异，酶切以后只有248BP片段，杂合子变异则为248BP、163BP和85BP。这种由单一碱基变异形成的多态性即为SNP，被认为是继限制性长度片段多态性RFLP和简短串联重复STR之后新一代的遗传标志，是基因变异中最多的一种，其最低的等位基因频率大于或等于1，因而不同于其他罕见变异。尽管就单个SNP而言只含有二种变异体，变异程度不如微卫星或小卫星DNA，但SNP在基I0碱基中有约3X5个SNP位点，大约占整个DNA多态性的90“。在任何已知或未知疾病基因附近都能找到众多的SNP，因此就整体而言，SNP的多态性要高得多1。现己成为研究基因组多态性和识别、定位疾病相关基因的一种重要工具。DN为多基因遗传性疾病有的学者将DN的发生分为三种遗传模式1主效基因作用模式，即认为DN是高血糖与某一基因多态相互作用的结果；2中效基因作用模式，即认为DN是血糖控制不良与几个基因中任意一个或几个基因多态相互作用所致，其中每个基因都有独立的作用，但对DN易感性有累加作用，其整体效应受人群中致病等位基因相对频率的影响3微效基因作用模式。即蹦是血糖控制不良与多个遗传位点的改变相互作用的结果，每个遗传位点的作用都是微效的，其合讨论力形成了洲的遗传易感性。DN属于哪一种遗传模式以及遗传因素如何影响糖尿病肾病的发生发展，目前仍无定论。本研究显示，在138例糖尿病患者中糖尿病肾病组DN组T等位基因和TG基因型分布频率均显著高于糖尿病非肾病组DN组基因分布频率升高更为显著0R值分别为306、3，863，X2分别为13499、14749，同时本研究发现DN一组与正常对照组相比较，TG基因型以及T等位基因分布频率无联，T等位基因和TG基因型可能是DN的风险修饰因子，是糖尿病肾病的单核苷酸多态性及可作为其遗传标志之一。众多研究证实DN是环境因素与遗传因素相互作用的结果，单纯有遗传基础并不一定导致糖尿病的发生。本研究选择糖尿病肾病可能的危险因素如年龄、病程、体重指数、收缩压、舒张压、空腹血糖、糖化血红蛋白、空腹胰岛素、甘油三脂、总以尿微量白蛋白排泄率作为因变量做LOGISTIC逐步回归分析，结果显示HENO基REGRESSION方程，统计学分析表明年龄、体重指数、收血红蛋白被选入LOGISTICTTG基因型是糖尿病肾病危险因素，在逐步回归分析过程中，除去病程、空腹OR2919，95可信区间为107797，说明其是糖尿病肾病的独立危险因素之一。终上所述，与某些DNA编码区中碱基突变的直接致病效应不同，HENOS第7外显核苷酸微卫星多态性分析等其他的研究方法更为简便可靠，扩增后不像后者那样重基因的频率很容易被估计，在临床应用中有更好的可操作性，可作为筛查DN遗传易感人群的手段，并通过关联分析和联锁不平衡分析寻找DN的易感基因，同时可以结合其他易感基因和或相关位点进行联合分析，为DN的旱期诊断提供更为理想的理论依据。本研究仅是从基因多念性方面对DN的易感基因进行了初步研究，用单核营酸多态性分析的方法，证实了在北方汉族2型糖尿病肾病患者中有HENOS第7外显子单核苷酸多态性的存在。迄今为止，国内外对2型糖尿病肾病易感基医的研究尚未取得结论明确结论，DN易感基因多态位点研究能否获得成功，并得出可靠结论，有赖于在了解DN病理生理基础上挑选正确的候选基因。并依赖于可使基因多态位点快速而准确定位的分子生物学实验室技术的发展。目前，中国人2型糖尿病易感基因定位已经取得了很大的进展，随着第三代遗传标记一单核苷酸多态性SNP的DNA芯片技术的应用，2型糖尿病肾病的遗传学研究必将从中受益，从而揭示DN的发病机制，有利于易感人群的早期筛查早期干预。5结论单核苷酸多态性与2型糖尿病患者糖尿病肾病的发生有关联，是糖尿病肾病的单核苷酸多态性并可作为遗传标志之一。2的独立危险因素。附录表1DM组与司呈掌对照组间临庆和实验室资料F较XS注糖尿病组与正常对照组的空腹血糖、甘油三酯有显著性差异PO05。附录表2DN一组与ON缉间临床和实验室资料比较XSP项目DN一组DN组性别女男32293938一一年585485460241013029龄岁病程年1104248120L251055687992069381143O73体重KG006身高CM163657791661679425。683。OL25，12388O33体重指数KGM21211078LO58收缩压MMHG12180713舒张压76355。08O53瑚LIG7686454糖化血红蛋白8481348591330641029258O09空腹血糖MMOLLL1L，28416空腹胰岛素MMOLL13454791230407014026尿素氮MMOLLL61L17L6，60330UMOLL8351132L92264380009肌酐036总胆固醇MMOLL5101475281，58甘油三酯MMOLLL13205L146064013049谷丙转氨酶MMOLL2721437256L1324208373504L谷草转氨酶MMOLL2Z，131106UMOLL21657567225，41908048尿酸1122758O00UAERUGLMIN4677177跗录圈1HENOS第7外显子PCR产物BANII酶切产物分析注共捡出85、163、248BP3砷F段。酶切以后仅见248BP片段为含突变等位基因的纯台子基因型TT少，正常组和糖尿病肾病组各测得1个和2个；完全酶切得到大小为163BP和85BP两个J段的是不含突变位点的纯合子基因型GG；DNALADDER。酶切以后三个片段都有的为杂合F墉九掣，|【；。MARKER为LOOBP附录表3100例正常人和138例糖尿病患者894GT基因型分布频率因理论值T5，并与TG基因型中分析，保证每个格子理论值T5，表4100例正常人和138侈L耱尿病患者894GT基因型分布频率的比较图2100例正常人和138例糖尿病患者894GT基因型分布频率的比较附录表5100例正常人和138倒糖屎病患者894GT等位基因分布频率表6100例正常人和138例糖尿病患者894GT等位基因分布频率的比较图3100例正常人和138例糖尿病患者894GT等位基因分布频率的比较附录表7正常对照组基因型频率的HARDYWEINBERG检验表没有统计学意义。表8糖尿病组基因型频率的HARDYWEINBERG检验表异没有统计学意义。ST表9糖尿病肾病各危险因素LOGIIC逐步回归分析结果VARIABLESINTHEEQUATION95OCLFORBSEWALDDFEXPBSIGEXPBLOWERUPPERL404LA病程5581LL25，038000T747L23STEP5LD00CONSTANT7991081287970033361089625100214001132173LSTEP2B病程耶LC14410，504L00L15931，2022T10465CONSTANT4LO10000008085146530L3C病程34810411262001141711561736STEPLHBMC49415I10，715。001L638L2L92202I535FBGZ6了08Z10，5790011306L_112LL000000CONSTANT一LL_505205731280108I00313801U6L7064D病程3228，859STEPHBATC533169LT，083T1锚L24SZ，332LFB62970861184300113461136L，594TG基因型1071512437II037291910697968CONSTANT一1236Z2231307141000，000AVRRIABLESENTEREDONL螨程STEPBVARIABLESENTEREDONSTEP2LBALCCENTEREDVATIABLESOFFSTEP3FBGDVUIAHLESENTEREDOLLSTEP4基医型19附录缩略语的中英文名称缩略语英文名称中文名称HENOSHUMANENDOTHELIALCEIL人内皮细胞型一氧化氮NITRICOXIDESYNTHASE合成酶SNPNUCLEOTIDESINGLEPOLYMORPHISM单核苷酸多态性DNDIABETICNEPHROPATHY糖尿病肾病UAERALBUMINEXECRETIONRATEURINARY尿微量自蛋白排泄率N0NITRICOXIDE一氧化氮DMDIABETESMELLITUS糖尿病EDTAETHYLENEDTAMINETETRAACETICACID7,胺四乙酸FBGBLOODFASTINGGLUCOSE空腹血糖FINSFASTINGPLASMAINSULIN空腹胰岛素HBALCALEHEMOGLOBIN糖化血红蛋白TCTOTALCHOLESTEROL总胆固醇TGTRIGLYRIDE甘油三酯RFLPRESTRICTIONFRAGMENTLENGTH限制性长度片段多态性POLYMORPHISMSTRSHORTTANDEMREPEAT简短串联重复PCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶链反应墨耋苎堕参考文献BBA1FREEDMANI，TUTTLEB，SPRAYJFAMILIALPREDISPOSITIONTONEPHROPATHDIABETESINAFRICANAMERICANSWITHNONINSULINMELLITUSJDEPENDENTYAMJKIDNEYDIS，1995，2557LO一713DINPIMARWA1DIABETICDISEASE2。NELSONG，KNOWLERC，PETTITTJ，ETKIDNEYINDIANSJDIABETESCARE，1993，161335341AL。NITRICOXIDEND。ETA，BELYAEV3RIPPINJD，PATELSYNTHASEGENEDIABETICANDMAR463POLYMORPHISMSMAR2003154268EPUBNIOXIDE4SHIMIZUR，ETA1ENDOTHELIALTRICT，ONUMAT，KAWAMORISYNTHASEANDOFTHEDIABETICRESC1INPRACT，DEVELOPMENTGENENEPHROPATHYDIABETES2002DEC583179855LINMA1LELEAIN4INTRONOFECNOSWILLNOTINCREASES，QUH，QIUGENERISKIN2THEOFDIABETICDIABETESOFCHINESENEPHROPATHYTYPEPOPULATIONNEPHRON2002AUG914768A1KLDOSEREDUCTASEISASSOCIATED6YAMAMOTOT，SATOT，ETGENEPOLYMERPHISMITHOFDIABETICINWITH1PROGRESSIONNEPHROPATHYJAPANESEPATIENTSTYPEDIABETESMELLITUSDIABETESOBESMETAB2003JAN5151577LEEA1CONTRIBUTIONSTOOFOXIDATIVESTRESSAY，CHUNGSS，ETPOLYOLPATHWAYINDIABETICCATARACT。JFASE8，1999，1323308ANDERSONAINA1DIABETICR，CHRISTIANSENS，ANDERSONJJK，ETNEPHROPATHY1TYPEDIABETESEPIDEMIOLOGIC8L50I9CRAVENFMNITRTCOXIDEINDIABETICP，DERUBERTISR，MELHEMNEPHROPATHYINT。1997，52S46一S53JKIDNEYOF10KOMERSSPARADOXESRANDERSONNITRICOXIDETHEDIABETICINKIDNEY，AMRENALJPHYSIOLJUN2846F112137PHYSI012003LISHIMASAKIHA1ASSOCIATIONOFTHEMISENSEVARIANTY，YASUEY，ETGLU298ASPIFTHEENDOTHELIALNITRICOXIDEWITHSYNTHASEGENEMYOCARDIALAMCOLLCARDIOL，199831156010INFARCTIONJJTASSOCIATIONOFNILRICTHEOXIDE12，NEUGEBAUERS，BABAT，WATANABESYNTHASEWITHANFORINCREASEDRISKTOGENEDIABETICPOLYMORPHISMPROGRESSION21参考文献IN2TYPENEPHROPATHYAADNAFLDISCOVERY13COLLINSS，BROOKSD，CHAKRAVARTICPOLYMORPHISMFORRESEACHHUMANRESOURSERES，1998，812VARIATIONJGENOMEGENETIC1229一123114张思仲人类基因组的单核苷酸多态性及其医学应用J中华医学遗传学杂志，1999，162119122OFHUMANICATIONSK，MIHM15WATTANAPITAYAKULMJ，YOUNGAPTHERAPEUTICIMPLPHARMENDOTHELIALNITRICOXIDESMTRENDSSYNTHASEGENEPOLYMORPHISCI2001236136816TESAUROPINTRACELLULAROFM，THOMPSONWC，ROGLIANIPROCESSINGENDOTHELIALNITRICOXIDEWITHDIFFERENCESINISOFORMSASSETIATEDSYNTHASEOFOFWITHSEVERITYCARDIOPULMONARYDISEASECLEAVAGEASPARTATEPROTEINSAT298PROCNATLACADUSCISA20009728322835VSGLUTAMATEPOSITIONCFFATIBENECOILGAONVARIANTOFTHEENDOTHELIAL17。HINGORANIAD，LIANGJANITRICOXIDEARISKFACTORFORSYNTHASEGLU298一ASPISMAJORCORONARYDISEASEINTHEUKCIRCULATION1999I0015151520ARTERY18HIBIA1ENDOTHELIALNITRICOXIDEK，ISHIGAMIT，TAMURAK，ETSYNTHASE