温郁金中新二萜类化合物c诱导人结肠腺癌sw620细胞凋亡的相关通路研究（可编辑）

温郁金中新二萜类化合物C诱导人结肠腺癌SW620细胞凋亡的相关通路研究396中国药理学通报CHINESEPHARMACOLOGICALBULLETIN2011MAR；273396401温郁金中新二萜类化合物C诱导人结肠腺癌SW620细胞凋亡的相关通路研究沈雁，吕宾，张烁，马忠俊1浙江中医药大学附属第一医院消化内科，浙江杭州310006；2浙江大学药学院现代中药研究所，浙江杭州310058中国图书分类号R2841；R32925；R73535022；R9791生长并诱导凋亡，其作用机制可能与抑制MAPK信号转导通路、活化CASPASE一3有关。文献标识码A文章编号10011978201103039606摘要目的探讨温郁金二萜类化合物C诱导人结肠腺癌关键词结肠腺癌；温郁金；二萜类；增殖；凋亡；MAPK；SW620细胞凋亡的作用机制。方法以5一氟脲嘧啶5FLUCASPASE一3OROURACIL，5FU为阳性对照药物；采用噻唑蓝METHYLTHIAZOLYLTETRAZOLIUM，MRRR还原法检测化合物C和5一FU对SW620细胞增殖的影响；用流式细胞术FLOWCYTOMETRY，结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，在世界范FCM检测两种药物诱导细胞凋亡的情况；用WESTERNBLOT法围内，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势I2J。鉴检测化合物C作用后，细胞中ERK、PERK、JNK、PJNK、P38、于其早期诊断策略尚不成熟，以及放化疗毒副作用PP38及CASPASE一3蛋白水平的变化。结果化合物C能抑所造成的临床应用限制，因此研发传统中药材中潜制SW620细胞的增殖活性，并明显诱导细胞凋亡，其抑制率在高效的抗癌活性成分不失为对抗结肠癌的一个新和凋亡率呈时间一浓度依赖性，且都明显高于5FU组；其选择。24、48和72H的IC分别为2975、1591和655MGL；温郁金是姜科姜黄属植物温郁金CURCUMAWE化合物C能浓度依赖性地下调细胞中ERK、JNK、P38及其相NYUJINYHCHENETCLING的干燥块根。研究表明，应磷酸化蛋白的水平，并刺激CASPASE一3的蛋白表达。结论它具有降脂、护肝、抗肿瘤、抗辐射等广泛的药理活温郁金二萜类化合物C能抑制人结肠腺癌SW620细胞的性J。近年来，温郁金的抗肿瘤效应日益受到关收稿日期20101104，修回日期20101227注研究发现其多种提取液在体内外均能抑制胃癌基金项目浙江省中医药普通课题研究计划NO2009CB014的形成和发展；其醇提物中的姜黄素和其醚提物中作者简介沈雁1985一，女，硕士生，研究方向中西医结合消化的榄香烯已被证实为显效的抗癌成分。在此基础系统疾病，EMAILSHENDANXI61115163TOM；上，笔者进一步从其醚提物中分离得到另一种全新吕宾1963一，男，教授，主任医师，博士生导师，研究的二萜类化合物C。本实验拟观察该化合物C对人方向中西医结合消化系统疾病，通讯作者，EMAILLVBINMEDMAI1_COMCN结肠腺癌SW620细胞增殖、凋亡的影响及相关信号SIGNIFICANTLYINHIBITEDLPSINDUCEDACTIVATIONOFMICRONEUROTOXICITYBYMEASURINGTHEHDAUPTAKEANDCOUNTINGOFTHIMMUNOREACTIVECELLSMICROGLIAWEREGLIAANDPRODUCTIONOFTNF一仅NOANDSUPEROXIDEINRATMESENCEPHALICNEURONGLIACULTURESANDMICROGLIAVISUALIZEDBYSTAININGFORTHECR3COMPLEMENTRECEPTORENRICHEDCULTURESINADDITION，THEPOTENCYORDEROFWITHMONOCLONALANTIBODY0X42THEPRODUCTIONOFNITHESEFIVEISOFLAVONESWASPRATENSEINDAIDZEINCALYTRICOXIDENOWASDETERMINEDBYMEASURINGTHEACCUCOSINFORMONONETINIFILONECONCLUSIONSA11FIVEMULATEDLEVELOFNITRITEINTHECULTURESUPERNATANTWITHTHEGRIESSREAGENT，ANDTHERELEASEOFTUMORNECROSISISOFLAVONESFROMTRIFOLIUMPRATENSEMAYPROTECTDOPAMFACTOROTTNFOTWASMEASUREDWITHARATTNF一ENINERGICNEURONSFROMLPSINDUCEDINJURYANDTHEIREFFECTSININHIBITINGMICROGLIAACTIVATIONMAYBEONEOFZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYKITTHEPRODUCTIONTHEMECHANISMSMOREOVER，THERANKORDEROFPROTECTIVEOFSUPEROXIDEWASDETERMINEDBYMEASURINGTHESUPERPOTENCYOFTHESEFIVEISOFLAVONESISPRATENSEINDAIDOXIDEDISMUTASESODINHIBITABLEREDUCTIONOFCYTOZEINCALYCOSINFORMONONETINIFILONECHROMECRESULTSALLFIVEISOFLAVONESDOSEDEPENDENTLYATTENUATEDLPSINDUCEDDECREASEINDOPAMINEUPKEYWORDSTRIFOLIUMPRATENSE；ISOFLAVONE；MICROGLIA；DOPAMINERGICNEURON；TUMORNECROSISFACTOROL；NITRICOXTAKEANDTHENUMBEROFDOPAMINERGICNEURONSINRATIDE；SUPEROXIDEMESENCEPHALICNEURONGLIACULTURESMOREOVER，THEYALSO中国药理学通报CHINESEPHARMACOLOGICALBULLETIN2011MAR；273397通路蛋白表达及活性的变化，来阐述其抗癌作用的阴性对照组A一空白对照组A100。生物学机制，为寻找有效的结肠癌治疗药物提供理14FCM检测细胞凋亡情况细胞培养并接种于论依据。中号培养皿中，每个培养皿610L，3ML，培养1材料与方法24H后换成含化合物C的培养液3ML干预，设40、55、70MGL3个终浓度的实验组及阴性对照组，11药物、试剂和仪器温郁金二萜类化合物C由浙江大学药学院现代中药研究所分离提供，其阳性对照组为相同浓度梯度的5FU组，每组重复3分子量为380，分子式为CH0。次。培养L2、24、48H和72H后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，PBS漂洗2次2000RMIN，5MIN，并用500L的BINDINGBUFFER悬浮细胞，再加入5LANNEXINVFITC混匀，室温、避光、反应515MIN后，上机检测。15WESTERBLOT检测蛋白表达将对数生长期细胞1X10个分别以0、40、55、70MGL化合物C作用48H后，用025胰酶消化、PBS漂洗，再加入5氟脲嘧啶5FLUOROURACIL，5一FU注射液由天150IXL新鲜配置的RIPA裂解液，放冰上裂解30津金耀氨基酸有限公司提供批号0910221，分子MIN，4C12000RRAIN。离心10MIN，收集上清液，量13008。LEIBOVITZSL一15培养基及025胰用BRADFORD法测定蛋白含量；各浓度组的蛋白均取酶均为杭州吉诺公司产品；胎牛血清购自北美GIBCO30G，加等体积上样BUFFER混合，IO0C变性5MIN公司；M1TR噻唑蓝干粉购自AMERESCO公司；AN后，以每孔20L的上样体积加入12的分离胶和NEXINVPI凋亡试剂盒购自BIOUNIQUER公司；兔抗5的浓缩胶中进行SDSPAGE电泳，之后用半干半P38、PP38、JNK、PJNK、ERK、PERK、CASPASE一3及湿转膜仪250MA电转25H将蛋白转移到PVDFBACTIN均为CELLSIGNALING公司产品；抗兔二抗及抗膜上；用含5BSA的TFBS01TWEEN一20，10鼠二抗为JASKSON公司产品。CO培养箱THERMO、MMOLLTRISHC1，PH75，150MMOLLNAC1生物安全操作柜THERMO、流式细胞仪BD、离心4C封闭过夜；分别用抗ERK、PERK、JNK、PJNK、机THERMO、电泳仪BD、半干半湿转膜仪BDP38MAPK、PP38MAPK、CASPASE一3、BACTIN的一抗等用于本实验。和相应二抗孵育，TRBS洗膜3次，每次10MIN；最后12实验细胞系和培养条件人结肠腺癌细胞用增强化学发光法ECL检测阳性信号，显影后根SW620株购自中国科学院院上海细胞库，生长于据彩色标准电泳指示条带MARKER中的位置来分析含10胎牛血清的L15培养基中，置37、体积分各电泳条带的性质。数为5的CO培养箱中常规培养。实验时取对数16统计学分析数据用SPSS170统计软件包生长期细胞。分析，结果用S表示，两组间均数比较用T检验，13噻唑蓝还原法MTT法检测细胞增殖抑制多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比情况细胞传代并接种于96孔培养板中，每孔较采用LEASTSIGNIFICANTDIFFERENCELSD法。10000个细胞，200L，孵育24H后吸弃上清液，每2结果孔加入含化合物C的L一15培养液200L，使终浓度21MTT测定结果二萜类化合物C及5一FU在分别为1O、20、40和70MGL；设阴性对照组仅10、20、40和70MGL的终浓度时对SW620细胞培养液干预和空白对照组不含细胞的血清培养的增殖均呈时间一浓度依赖性的抑制作用FIG1；基，阳性对照组每FUJI入含5FU的培养液200L，化合物C作用24、48和72H后的半数有效抑制浓使其终浓度同化合物C每个剂量设3个重复孔。度IC5O分别为2975、1591和655MGL；各继续孵育24、48和72H，实验终止前4H添加5G时间段、各浓度的化合物C对SW620的抑制率均较L的MTY液20L后再培养4H，弃上清并加入同时间、同浓度的5一氟脲嘧啶为高P001。DMSO150IXL，上微量振荡器振荡10MIN，立刻用酶22FCM测定结果两种药物均能不同程度地诱标仪测定吸光度值A，检测波长为570NM。计算导SW620细胞发生凋亡，其中化合物C的促凋亡效细胞生长抑制率。抑制率阴性对照组A一应呈明显的时间一浓度依赖性FIG2；作用12H，空白对照组A一实验组A一空白对照组A40和55MGL化合物C组与同浓度5FU组的凋398中国药理学通报CHINESEPHARMACOLOGICALBULLETIN2011MAR；273O59勰加吣土OOOCONTROL317028540107219040842863士O551911O5654472146140M17941010A443018555653188155358912356338024582761981700“000O5嚣901粥亡率问比较，差异无统计学意义；此外各时间段、各SW620细胞的增殖，并诱导凋亡，从而逆转癌细胞十浓度时，化合物C的促凋亡作用均强于5FUTAB本身存在的生长失控、凋亡失能特性，表现出高效的4叭叭控盼士1，P001。抗癌活性，且其对结肠腺癌细胞的毒性作用明显高01O123WESTERN1陀BL7OT检测1结果与阴性对照组相比，于临床上常用的化疗药物5FU。十化合物C干预组的ERK、JNK及P38MAPK的表达丝裂原活化的蛋白激酶MITOGENACTIVATEDPRO十水平均受到抑制；而三者相应的磷酸化水平，即PTEINKINASE，MAPK通路是细胞信号转导网络中的重踞加一ERK、PJNK和PP38的表达则受到更为明显的抑要成员之一，它能通过高度保守的“瀑布样”磷酸化012O制；相反，CASPASE3的蛋白量则呈上调趋势FIG3，P级联反应将细胞外刺激与细胞内基因表达和胞质功粥能活动连接起来，参与细胞的增殖、分化、运动、凋亡001。上述蛋白的抑制活化效应均表现出剂十O418量依赖性的特点。等多种生命活动。目前在哺乳动物细胞中鉴定出了土士3讨论OOOO3条主要的亚通路，即细胞外信号调节蛋白激酶058，O结肠癌的发生发展是一个多基因参与、涉及多EXTRACELLULARSIGNALREGULATEDKINASE，ERK通路、C阶段演变的复杂过程。在外界致癌信号的过度刺激JUN氨基末端激酶CJUNNTERMINALKINASE，JNK应下，相关转导通路中关键效应子发生异常的激活失激活化蛋白激酶STRESSACTIVATEDPROTEINKINASE，活，引起下游原癌基因和抑癌基因的表达失衡，进而SAPK通路和P38丝裂原活化蛋白激酶P38MITO导致肠上皮细胞表型的转变。癌转的细胞能逃避生GENACTIVATEDPROTEINKINASE，P38MAPK通路，已被证理性凋亡点的监控而达到永生化，同时还获得对周实在包括结肠癌在内的多种消化系肿瘤中存在异常围组织、器官的高侵袭力。因此，诱导肿瘤细胞凋亡表达或活化，提示其与肿瘤的发生发展问存在密切将是治疗结肠癌的一条积极有效的途径J。联系HJ。其中ERK通路主要接受有丝分裂原的温郁金是临床常用的传统中药材，目前国内外刺激，活化后能促进细胞增殖、分化、骨架重构等，与肿瘤细胞的恶性生物学行为问关系密切15；JNK和对其有效成分的研究主要集中于姜黄素和榄香烯，并已证实这两种成分具有良好的抗癌活性J。我P38通路则主要接受各种应激和病理性损伤信号，们的前期研究结果显示，_9一温郁金的水提物、醚有时也可被有丝分裂原所活化，产生的效应在很大提物和醇提物在体内外均能抑制人胃癌SGC一7901程度上取决于信号类型和或自身亚型的不同，可细胞增殖，且后两者尚具有良好的凋亡诱导效应，其以表现为促进凋亡或抵抗、修复损伤这两种截然相反的结果16。CASPASE3是凋亡经典通路的下游蛋作用机制可能与下调血管内皮生长因子VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR，VEGF、环氧合酶一2CYCLOX白元件，被活化后则成为最关键的凋亡执行者，能促YGENASE2，COX一2的水平以减少瘤灶内微血管密度进绝大多数凋亡事件的开启。我们的实验结果MICROVESSELDENSITY，MVD、提高血浆和组织中生长显示，化合物C能浓度依赖性地抑制ERK、JNK和抑素SOMATOSTATIN，SS的表达、抑制胰岛素样生长因P38的水平，而对三者磷酸化的抑制程度更为显著；子INSULINLIKEGROWTHFACTOR，IGFI和的分泌等相反，它能明显诱导活性CASPASE一3的蛋白表达。推有关。为深入了解并开发温郁金中潜在的其他抗癌测化合物C可通过下调ERK通路介导的分裂生存活性成分，我们成功地从其醚提物中提取出一种新效应、抑制JNKP38通路介导的细胞保护效应，同型二萜类化合物C，其化学结构和性质都有别于姜时传递活化信号至凋亡效应子CASPASE一3，进而诱导黄素和榄香烯。通过本次实验发现，该化合物C能人结肠腺癌SW620细胞发生凋亡。以时间一浓度依赖性的方式抑制人结肠腺癌综上所述，温郁金醚提物中的二萜类化合物C中国药理学通报CHINESEPHARMACOLOGICALBULLETIN2011MAR；273401LIFERATIONANDAPOPTOSISOFHUMANCOLONADENOCARCINOMACELLSOFINSULINLIKEGROWTHFACTORI，INSULINLIKEGROWTHFACTORLIANDSW620JCHINPHARMACOLBULL，2008，2467827VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTORJWORLDCHINJDIGESTOL，6LIX，WANGG，ZHAOJ，ETA1ANTIPROLIFERATIVEEFFECTOFBETAELEMENE2004，121127613INCHEMORESISTANTOVARIANCARCINOMACELLSISMEDIATEDTHROUGHAT12WANGW，WANGX，PENGL，ETA1CD24DEPENDENTMAPKPATHWAYRESTOFTHECELLCYCLEATTHEG2MPHASEJCELLMOLLIFESCI，ACTIVATIONISREQUIREDFORCOLORECTALCANCERCELLPROLIFERATIONJ2005，62894904CANCERSCI，2010，101111297XIECY，RANGW，LIM，ETA1CELLAPOPTOSISINDUCEDBYDELTAEL13GUOK，HUY，ZHOUH，ETA1INVOLVEMENTOFPROTEINKINASECBETAEMENEINCOLORECTALADENOCACINOMACELLSVIAAMITOCHONDRIA1MEDIEXTRACELLULARSIGNALREGULATINGKINASE12P38MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEHEATSHOCKPROTEIN27ACTIVATIONINHEPATOCELLULARATEDPATHWAYJYAKUGAKUZASSHI，2009，129111403138刘晓真，张宏颖姜黄素与肿瘤细胞作用的分子机制J大连CARCINOMACELLMOTILITYANDINVASIONJCANCERSCI，2008，99348696医科大学学报，2008，30546588LIUXZ，ZHANGHYMOLECULARMECHANISMOFEFFECTOFCURCUMINON【14MISHRAP，SENTHIVINAYAGAMS，RANGASAMYV，ETA1MIXEDLINEAGEKINASE3JNK1AXISPROMOTESMIGRATIONOFHUMANGASTRICCANCERTUMORJJDALIANMEDUNIV，2008，30546589俞林峰，吕宾，徐磊，等温郁金对饮用MNNG大鼠胃黏膜CELLSFOLLOWINGGASTRINSTIMULATIONJMOLENDOCRINOL，2010，24血管内皮生长因子和环氧合酶_2表达的影响J胃肠病学，35986072007，123140315周四桂，袁茜，潘雪刁，等ERK12和P38MAPK介导BAP9YULF，LNB，XUL，ETA1EFFECTSOFCURCUMAEONEXPRESSIONSOFTAAM抑制RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞分化的机制研究VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTORANDCYCLOOXYGENASE2INGASTRICJ中国药理学通报，2010，269114650MUCOSAOFRATSFEDWITHMNNGJCHINJGASTROENTEROL，2007，1215ZHOUSG，YUANX，PANXD，ETA1ERK12ANDP38MAPKMEDIATETHEEFFECTOFBAPTAAMINHIBITINGRANKLINDUCEDBONEMAR31403ROWMACROPHAGESDIFFERENTIATIONJCHINPHARMACOLBULL，2010，10徐毅，吕宾，项柏康，等温郁金对鼠血浆和胃组织生长抑269114650素水平的影响J中国中西医结合消化杂志，2004，124222416文军，徐明P38MAPK激酶抑制剂增强二烯丙基二硫化10XUY，B，XIANGBK，ETA1EFFECTOFEXTRACTOFRADIXCURCUMAE物诱导CNE2细胞凋亡J中国药理学通报，2003，19441823ONSOMATOSTATININPLASMANDGASTRICTISSUEJCHINJLNTEGRTRADWESTMEDDIG，2004，1242224，16WENJ，XUMINHIBITIONOFP38MAPKKINASEENHANCESDIALLYLDI11何必立，吕宾，徐毅温郁金对胃癌细胞的抑制作用及其SULFIDEINDUCEDAPOPTOSISINHUMANCNE2CELLSJCHINPHARMACOLBULL，2003，19441823对IGFI、1GFH表达的影响J世界华人消化杂志，2004，12112761317MOURATIDISPX，COLSTONKW，DALGLEISHAGDOXYCYCLINEINDUCES11HEBL，LB，XUYINHIBITIONOFCOMMONTURMERICONHUMANGASCASPASEDEPENDENTAPOPTOSISINHUMANPANCREATICCANCERCELLSJTILECAICINOMACELLLINESGC7901ANDITSEFFECTONTHEEXPRESSIONNTJCANCER，2007，120474352APOPTOSISOFHUMANCOLONADENOCARCINOMACELLLINESW620INDUCEDBYDITERPENOIDCFROMRADIXCURCUMAEANDITSRELATEDPATHWAYSSHENYAN，LCBIN，ZHANGSHUO，MAZHONGJUN1DEPTOFGASTROENTEROLOGY，THESAFFILIATEDHOSPITALOFZHEFIANGCHINESEMEDICALUNIVERSITY，HANGZHOU310006，CHINA；2COLLEGEOFPHARMACY，ZHEJIANGUNIVERSITY，HA