膜分离茶多酚工艺初步研究 论文正文

毕业论文（设计）题目膜分离茶多酚工艺初步研究指导老师专业班级生物技术及应用0701姓名学号2010年5月30日摘要研究膜分离技术制备低咖啡因高表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量茶多酚生产工艺。主要采用高速离心、微滤、超滤、纳滤技术，高效液相色谱检测，结果表明，高速离心具有较好的澄清效果，微孔膜在孔径为5M,压力01MPA，流速为20ML/MIN分离咖啡因去除率023，EGCG损失率018。超滤膜5KDAL（膜单位道尔顿）在压力05MPA，流速7ML/MIN分离咖啡因去除率018，EGCG损失率011；超滤5KDAL跟1KDAL分离咖啡因去除率028，EGCG损失率004。纳滤膜浓缩压力05MPA，流速5ML/MIN咖啡因去除率023，EGCG损失率025。膜的使用及选择结合木质纤维素树脂分离技术，在一定程度上降低咖啡因的含量使其达到标准04，提高EGCG的含量达到标准50。所得产品得率为73，咖啡因的纯度为036，EGCG纯度为5950。关键词膜分离；微滤；超滤；纳滤；咖啡因；EGCG目录引言11材料与仪器211实验材料212实验试剂213试验仪器22实验方法321分离液制备3211提取液制备3212提取液离心分离322微孔膜分离323超滤膜分离324树脂分离4241上样液调配4242柱平衡及上样洗脱425纳滤膜浓缩526分析方法5261HPLC分析条件5262标准曲线制作5263茶多酚含量计算方法53结果与分析631标准曲线制作632微孔膜分离效果733超滤膜分离效果与比较834纳滤膜浓缩效果94总结与讨论10参考文献11引言膜分离技术是21世纪最具有发展潜力的高新技术，分离过程以选择性透过膜为分离介质，在压力差浓度差等推动力下,原料侧组分选择性地透过膜,以达到分离、提纯的目的1。由于其兼有分离、浓缩、纯化的目的，选择合适的膜与操作参数，可得到较高的回收率，处理系统可密闭循环，防止外来污染，不外加化学物质，透过液可循环使用，降低成本，减少对环境的污染。在各种工业生产中得到广泛的应用。已开发应用的膜分离技术有反渗透RO、纳滤NF、超滤UF、微滤MF四种2。大多数膜分离过程中物质不发生相变化,分离系数较大,操作温度在室温左右。微滤用于悬浮液（粒子粒径为0110M）的过滤；超滤以低能耗、无热效应、无相变化、结构简单、占地小、操作简便、使用的压力低、产水量较大易于实现自动化的特点而广泛地应用于多种物质的分离、浓缩、净化等领域；纳滤膜介于超滤与反渗透之间，能截留分子量为3001000的小分子物质，其集浓缩与透析为一体，可使溶质的损失达到最小，反渗透膜能将水与低分子量物质分离，其典型应用是海水脱盐34。将膜分离技术应用于茶多酚制品的生产工艺中具有深远意义。由于浸提过程中的富集，一般茶提取物中咖啡因的含量都远远高于鲜叶，将茶提取物作为功能成分在食品和药物上利用时，脱去咖啡因是提高产品附加值的前提基础条件56。目前膜分离浓缩茶多酚的研究报道较少，浙江一企业需要咖啡因低于04,EGCG高于50，在之前的研究中，咖啡因的含量061，EGCG的含量4550达不到所需要求。因此膜的使用研究变的尤为重要，本文就对微孔膜、超滤膜分离，纳滤浓缩作了一些研究，膜使用让结果达到了所需要求，并能扩大中试生产。1材料与仪器11实验材料茶叶（炒青大宗茶沫，购于金华浦江）表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG（实验室提供）12实验试剂95乙醇（食用级），柠檬酸、酒石酸亚铁、磷酸氢钠、磷酸二氢钾等均为分析纯试剂，乙醇（色谱纯），冰乙酸，水为蒸馏水。13实验仪器核酸蛋白自动测定仪（SHQT6A上海琪特分析仪器有限公司）；N2000色谱数据工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）；分光光度计（752N上海精密科学仪器有限公司）；分析天平（SPS202F梅特勒托利多称重设备系统有限公司）；喷雾干燥器（SY6000上海世远生物设备工程有限公司）；冷冻干燥仪（12LD德国ALPHA）；超声波清洗器（KQ500DA昆山市超声仪器有限公司）；层析柱（1640MM，40800MM上海亚荣生化仪器厂）；旋转蒸发仪（RE52AA上海亚荣生化仪器厂）；真空泵（SHBIII郑州长城科工贸有限公司）；微孔过滤膜上海市新亚净化器件厂；超滤膜小试平板超滤膜设备FLOWMEM0250厦门世达膜科技有限公司；卷式膜小试设备（RNF0460厦门世达膜科技有限公司）；高速离心机DL5型上海安亭科学仪器厂。2方法21分离液的制备211提取液制备称取10000G绿茶沫，以112比例加30酒精浓度的溶剂，65水浴超声加热提取，30MIN每15MIN停2MIN，纱布过滤提取液、重复一次，合并滤液，即得提取液17L。212提取液离心分离得到提取液，高速离心机离心，离心料液共17L，转速10000转/MIN，流速10M3/H，压力05MPA，流速5L/MIN，所得澄清溶液16L左右，取16L进行分离即为待分离的分离液。22微孔膜分离微滤膜主要应用于截留颗粒物,液体的澄清以及大部分细菌的去除,并作为超滤过程的前处理。取分离液16L溶液通过孔径为5M滤芯，压力为01MPA，流速20ML/MIN，收集滤液，水洗浓缩液，关机后收集系统残留液，抽取透过液和截留液的溶液过滤分别取滤液做检测分析。试验工艺图21如下图21微孔膜试验流程示意图23超滤膜分离超滤膜能截留分子量在上千至数十万的大分子,除能完成微滤的除颗粒、除菌和澄清作用外,还能除去微滤膜不能出去的病菌、热源、胶体和蛋白质等大分子化1原料液槽2输液泵3压力表4微滤组件5循环阀合物。超滤以全回流方式进行，在超滤时一般情况下，膜压力为05MPA，流速7ML/MIN经微孔膜过后取15L透过液先通过截留分子量5KDAL的膜饱超滤，再通过截留分子量1KDAL的膜饱超滤。开机进料液并收集滤液，水洗浓缩液，关机后收集系统残留液。抽取透过液和浓缩液的溶液过滤分别取滤液做检测分析。试验工艺图22如下图22超滤、纳滤试验流程示意图24树脂分离241上样液调配将精滤液按比例调配成PH4，酒精度为10的绿茶溶液，为上样液。242柱平衡及上样洗脱柱平衡用10酒精，柠檬酸调PH4平衡树脂柱，使整个树脂柱体系处于酒精度为10，PH4。上样量取500ML，上样以V15L/MIN流速上样，上样完成后静置10MIN。10洗脱以5BV（层析柱床程）体积的10酒精PH4洗脱，流速控制在16L/MINV18L/MIN。40洗脱以3BV体积的40酒精洗脱，流速控制在17L/MINV19L/MIN。70洗脱以2BV体积的70酒精洗脱，流速控制在17L/MINV19L/MIN。1原料液槽2输液泵3压力表4反渗透（超滤、纳滤组件）5流量计6循环阀7浓液阀8流量计阀25纳滤膜浓缩采用NF200卷式纳滤组件，在压力050MPA、流速5ML/MIN室温条件下操作运行，试验流程如图2所示。取40洗脱液进行纳滤操作，开机进料液并收集浓缩液，关机后收集并洗出系统残留浓缩液，浓缩液分别做检测分析。浓缩液即得茶多酚成品。26分析方法261HPLC分析条件1）流动相配制A相05冰醋酸3乙腈水定容B相05冰醋酸30乙腈水定容2）戴安PH680高效液相色谱仪，色谱柱C18柱250MM46MM,5UM，V1ML/MIN，波长280NM，进样量20UL，柱温30，检测器UVD170U紫外检测器流动相变化如表21表21HPLC流动相配比随时间变化表检测时间（MIN）A相B相045MIN10004550MIN01005060MIN1000262标准曲线制作配制标准溶液准确称取表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）0250G,准确称取咖啡因0125G,配成母液5MG/ML,配成EGCG为05，1，15，2，25MG/ML的浓度，用于制作标准曲线。263茶多酚含量计算方法茶多酚得率计算经验公式如下AA1315N1V1/A0315N0V0公式21公式中变量含义A得率；A0原液茶多酚检测吸光度；A1茶多酚检测吸光度；315经验值（企业检测经验值）；N0茶多酚检测过程原液稀释的倍数；N1茶多酚检测过程第二次稀释的倍数；V0原溶液体积；V1第二次检测溶液体积；3结果与分析31标准曲线的制作将0、05、1、15、2，25MG/ML6个不同浓度的EGCG和咖啡因标准品，按照261检测方法，得样品浓度与样品出峰面积相应值依次为0、185938、376523、531483、7143、856011（EGCG）,0、192747、371133、501032、650444、767510（咖啡因）；将此浓度与出峰积分面积值在EXCEL中进行线性回归，制得标准曲线如图31、32所示EGCG标准曲线Y34401X14035R20998020040060080010000123浓度（MG/ML峰面积A系列1线性系列1图31EGCG标准曲线图咖啡因标准曲线Y30517X32344R209922020040060080010000123浓度（MG/ML峰面积A系列1线性系列1图32咖啡因标准曲线图由图31、32可得EGCG标准曲线为Y34401X14035，R20998咖啡因标准曲线为Y30517X32344，R209922。32微孔分离效果微孔膜分离取分离原液16L通过孔径为5M滤芯，压力为01MPA，流速20ML/MIN，收集截留液2L、透过液14L检测结果如图33所示050101502025030350404505050605246081,20,246830儿茶素检测109由FOUNDER修改二号茶叶30酒精提取UV_IS1MAUMIN1689253174387519767729468259689102612918217214319853698WL280NM0501015020250303504045050506051,052,30儿茶素检测7微孔膜截流液UV_ISMAUMIN1924837819647636187193426WL8NM2227323754254081501,27,2儿茶素检测0微孔膜透过液UV_IS1MAUMIN82941976472562679811124729WL2NM图33微孔膜分离原液、微孔截留液、微孔透过液液相检测分析图备注1为咖啡因检测峰2为EGCG检测峰；以下HPLC图谱做同样标识。结合茶多酚含量检测与图33检测分析结果，得出分离液16L稀释5倍A0649茶多酚含量227，咖啡因含量1643、EGCG含量1903。微孔截121212原液截留液透过液留液2L稀释5倍A10607茶多酚含量2123。咖啡因含量1050、EGCG含量1033。微孔透过液14L稀释5倍A20650茶多酚含量2273，咖啡因含量1259、EGCG含量1554，茶多酚得率8763。由图33得出，微孔膜的使用降低咖啡因含量，同时EGCG含量也相应的减少了。32超滤分离效果及比较超滤膜分离膜压力为05MPA，流速7ML/MIN经微孔膜过后取14L透过液结果检测如图34下0501015020250303504045050506012034506780儿茶素检测6850截流液UV_IS1MAUMIN937278694267353419WL280NM112233445050506071,0257,02573,0儿茶素检测50透过液UV_IS1MAUMIN8727835176271267826934117829WL280NM05010150202503035040450505060525071,2507,2573,儿茶素检测69截流液UV_IS1MAUMIN87294378641593617684692569129340471623WL12334450505060201,2507,273,儿茶素检测31透过液UV_IS1MAUMIN183978652637341082WL28图34超滤膜过分子量5KDAL、1KDAL截留液、微孔透过液液相检测分析图从图34中得出5KDAL截留液2L稀释5倍A30650茶多酚含量227。咖啡因含量1290，EGCG含量1035。5KDAL透过液12L稀释5倍A40400茶多酚含量1399，咖啡因含量1034，EGCG含量1377。茶多酚得率5275。1KDAL截留液2L稀释5倍A50485茶多酚含量1696咖啡因含量1098，EGCG含量1160。1KDAL透过液12L稀释5倍A60358茶多酚含量1347，咖啡因含量908，EGCG含量1491。茶多酚得率4721。从上述图谱可以看出，不管是过5KDAL膜还是1KDAL膜截留液中咖啡因含量都121212125KDAL截留液5KDAL透过液1KDAL截留液1KDAL透过液较高，说明二种膜孔径都能有效的去除一定的咖啡因，但EGCG含量也有所降低。33纳滤膜浓缩效果将40洗脱液溶液通过蒸馏法检测含固率，同时结合高效液相色谱法测定咖啡因、EGCG含量得咖啡因含量0607、EGCG含量6077，检测HPLC图谱如图35所示051052053054050560501,502,503,茶多酚检测1240浓缩液UV_IS1MAUMIN16478218269577340981621132WL280NM图3540乙醇洗脱液HPLC检测图谱将40洗脱液纳滤浓缩，整个浓缩时间跨度为24小时，浓缩冷冻干燥后测得茶多酚得率为73，其中咖啡因含量047、EGCG含量4563，检测HPLC图谱如图36所示051052053054050560501,502,50茶多酚检测1804MGUV_IS1MAUMIN193876429728587314926587316WL280NM图3640乙醇洗脱液干燥物HPLC检测图谱从图35、36比较得出纳滤能有效去除咖啡因，EGCG含量也降低（由于纳滤时间长，24小时），可能EGCG有部分被氧化原因造成，但在生产中采用大型的纳滤设备，浓缩时间大大减少，这个变化可以避免，这也正是下步在企业需要验证与解决的技术关键。4总结与讨论本文主要研究膜分离技术制备低咖啡因高EGCG茶多酚工艺研究，研究表明微孔膜孔径为5M滤芯,压力01MPA，流速为20ML/MIN分离咖啡因去除率023，EGCG损失率018。超滤膜5KDAL（膜单位道尔顿）在压力05MPA，流速7ML/MIN分离咖啡因去除率018，EGCG损失率011；超滤5KDAL跟1KDAL分离咖啡因去除率028，EGCG损失率004。纳滤膜浓缩压力05MPA，流速5ML/MIN咖啡因去除率023，EGCG损失率025。从这些数据看出，微孔膜、超滤膜5KDAL、1KDAL同时使用及纳滤膜咖啡因去除率相对较高，考虑经济成本，仅考虑微滤膜跟纳滤膜的使用，研究发现微滤膜、纳滤膜的使用，所得产品得率73，咖啡因的纯度为036，EGCG纯度为5950。微滤膜用于茶多酚浸提液的初步分离，造成一部分功能成分的损失，可研究孔径更小的微滤膜进行分离。超滤膜可有效地澄清茶多酚浸提液，固体杂质去除率高并截留了大部分的果胶、可溶性蛋白质、多糖等大分子物质，而使绝大多数的茶多酚透过。为减小超滤膜对茶多酚的截留率，操作过程中在保证除杂效果的基础上可适当增大膜的表面流速78。在保证茶多酚透过率的基础上也可考虑选用截留分子量更小的超滤膜来澄清茶多酚浸提液，从而提高后期茶多酚的纯度。而膜在连续使用一段