系统性红斑狼疮患者外周血il14的表达研究硕士论文

学校代码学号四川大学临床医学硕士专业学位论文题目丕缝蛙红窭夔痊皇耋处围堡墨的蠢达硒窒二六年四月溅英文缩写词表缩写词英文全称吐中文系统性红斑狼疮外周血单个核细胞白细胞介素逆转录一聚合酶链反应系统性红斑狼疮疾病活动指数曲高分子量细胞生长因子铆膜白细胞介素受体可溶性白细胞介素受体双链“血自然杀伤细胞刺激因子干扰素肿瘤坏死因子声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工怍及取得的研究成果。据我所知除了文甲特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期问在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。申请人彻氧指导教师系统性红斑狼疮患者外周血的表达研究研究生杨闵导师杨南萍副教授中文摘要目的探讨系统性红斑狼疮疾病活动与表达的关系材料和方法用逆转录一聚合酶链反应（）半定量方法检测例系统性红斑狼疮患者外周血中白介素一的表达水平。分析自介素一的表达水平与活动性指数（）的相关性。结果活动期系统性红斑狼疮患者外周血中自介素一链的表达高于非活动期（卸）及正常对照组（），链的表达与非活动期患者相比无显著性差异（），但仍显著高于正常对照组（）。非活动期患者与正常对照组相比，表达差异无统计学意义（）。白介素一的表达与无相关性（）。结论活动期系统性红斑狼疮患者外周血白介素的表达较正常对照升高，但与无相关性。，可能参与系统性红斑狼疮的病理发病过程。关键词红斑狼疮，系统性白介素；逆转录一聚合酶链反应一（，）（）（）一）厂口（）曲口），广（），）口）一，；广；系统性红斑狼疮患者外周血的表达研究研究生杨闵导师杨南萍副教授刖置系统性红斑狼疮（，）是一种多器官系统受累的自身免疫性疾病。其特征是淋巴细胞与多克隆淋巴细胞异常活化。产生多种自身抗体以及形成免疫复合物导致组织器官损伤。患者体内存在着严重的免疫紊乱及细胞因子网络失衡。但迄今为止，该病病因及发病机制尚未完全阐明。白介素（，）又称为高分子量细胞生长因子（，），主要由滤泡树突状细胞和活化的细胞产生。研究发现（）体外实验中，可增强生发中心的淋巴细胞增殖，提高记忆性细胞的存活；（）用转基因载体建立的，转基因小鼠出现狼疮样病变；（）人基因座位于人染色体，此区经连锁分析证实为狼疮敏感性基因座，而小鼠，基因座位于第号染色体临近，和小鼠狼疮敏感性基因座位置相同。上述理论可以看出，和有较密切的关系，但目前有关二者研究尚未见报道。因此，本研究采用逆转录一聚合酶链反应（）技术对例患者和例正常人外周血中转录产物和两个亚基的表达进行了，以探讨，在发病中的作用。材料与方法研究对象纳入年月至年月在我科住院的例患者，均为女性，年龄岁，平均岁。所有患者均符合美国风湿病学会年修订的系统性红斑狼疮分类诊断标准。所选患者均为首次诊断，采血前未用任何药物治疗，无近期服用激素及其他免疫抑制剂治疗史，且未合并有其他结缔组织疾病。采用疾病活动指数（）评分法评估所有病例，分为活动期组例，分为非活动期组例。正常对照组例为年龄相仿的女性健康志愿者。表病例分组及一般资料试剂盒试剂盒，试剂盒试剂盒北京天为时代科技有限公司主要实验仪器及分析软件表主要实验仪器及分析软件名称型号超净工作台离心沉淀机高速台式离心机全自动仪苏净集团泰安公司电泳仪兀照相机软件实验方法的提取28静脉取空腹肝素化全血，采用取总，具体方法试剂盒提取全血，加，将离心管颠倒数次轻轻混匀，室温，在此过程中再次颠倒混匀普通离心机离心后去上清，残留约残留液体，将细胞沉淀物漩涡混匀加入，颠倒混匀次后加入，轻轻颠倒混匀次，冰浴普通离心机离心，收集上清于塑料离心管中，室温离心沉淀将上清转移至新的塑料离心管中，每管，再每管加入异丙醇，轻轻颠倒混匀次室温离心沉淀，可见小而透明的小球，弃上清，沉淀物加入乙醇颠倒混匀洗涤，室温离心沉淀，弃上清自然干燥每一样品加入，放冰浴至少充分溶解，强漩涡混匀，合并分装于塑料离心管中，每管耻，低温保存取加指示剂（，产品）在含溴化乙锭（）的琼脂糖凝胶中电泳（电压），紫外灯下观察结果。的合成采用公司试剂盒，具体方法取提取好的（使用前强漩涡混匀，吸放液体数次确保充分混匀），轻轻震荡混匀，仪后冰浴加入，（），仪后冰浴加入却（）仪，分装分装于塑料离心管中，低温保存引物设计及合成链引物序列从和一。，链引物序列和。以一肌动蛋白（）为内参照，引物序列（而和（。以上引物均由基础免疫实验室提供。目标扩增产物长度分别为，。扩增采用部埘试剂盒，其中包含细聚合酶、反应缓冲液、反应的增强剂，优化剂及稳定剂，浓度为。反应体系总体积“，其中，上下游引物各“，细嬲】【“，加至，并设置空白对照。反应条件为预变性，（变性，退火，延伸，共计个循环，末轮循环延伸。样本空白对照【一一翁黪一上游引钫一山下游引钫山舶删吼山山，山一山土图加样图示产物分析取“反应产物在含溴化乙锭（）的琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察结果并照相。图像经软件进行灰度分析，均以为基准校正。数据进行统计分析当资料服从正态分布或总体方差齐时，采用检验或方差分析；当资料不服从正态分布或总体方差不齐时，采用检验或秩和检验，来比较组间差异是否有统计学意义。显著性检验水平，当时差异有统计学意义；当时，差异无统计学意义。图电泳图片（上图为总图片，左下图为患者图片，右下图为正常对照图片）结果基线比较表基线比较结果秩和检验进行基线比较结果显示各组间性别，年龄差异无统计学意义（），基线稳定，具有可比性。活动期组月活动期组差异有统计学意义（）。在各组问表达比较表，在各组问表达比较图，在各组间表达比较秩和检验比较链和且链表到在组间有无差异，结果见表表在各组间表达比较统计学检验结果活动期系统性红斑狼疮患者外周血中自介素一链的表达高于非活动期（）及正常对照组（葺），链的表达与非活动期患者相比无显著性差异（），但仍显著高于正常对照组（）。非活动期和正常对照组相比，表达差异无统计学意义（）。表达与相关性分析表各组与，表达进行秩相关检验表与表达相关性分析统计检验结果显示白介素一的表达与无相关性。讨论系统性红斑狼疮（，）是一种以淋巴细胞与多克隆淋巴细胞异常活化为特征的自身免疫性疾病。迄今为止，该病的病因及发病机制尚未完全阐明，研究表明与遗传以及环境因素有关，。但是临床表现异质性很强，某些仅有皮肤和关节表现的患者和那些多系统受累的患者临床进程可能完全不同，各类患者的免疫指标变化也不尽相同，并不能从免疫指标的变化来区分临床各种类别【”。更为复杂的是相同临床类型的患者因为其种族不同，免疫检查结果也可能大不相。这些情况使人们有理由详细分析各类型的易感基因，从而最终了解诱导各种特定临床类型的的环境因素与遗传变异之间的关系，而治疗也最终将针对每一位患者的特定遗传变异和免疫功能紊乱而个性化。目前已经建立了各种特定基因变异的动物模型，这些特定的基因改变可以引起动物狼疮样病变和血清学变化。这些基因包括调节淋巴细胞增殖【】抑制凋亡【，调节细胞受体信号哆，负责自身抗原降解和清除吲以及免疫复合物清除【等基因。这些基因很可能和人类某些患者发病有判】，但是没有一个基因在所有患者中都表现异常，这正说明是一个多基因遗传病，其发病与遗传的异质性有关并受各种环境因素的影响。在众多敏感基因中，与本课题相关的是和基因座，此基因位于小鼠第号染色体，临近”，在小鼠狼疮模型中和与多反应性免疫球蛋白，高活性细胞以及病理性浆细胞的形成有关【“卸。此区和人号染色体为同线基因（）而人经连锁分析证实为狼疮敏感基因座【，此区也正包含白细胞介素的基因。白细胞介素（，）是一组具有介导白细胞间相互作用的细胞因子，非特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起作用，在免疫系统。一、中具有重要的生理功能。自年第一个白细胞介素被命名后，发现和克隆新的白细胞介素一直是国际免疫学研究的热点。白细胞介素（一，），又称为高分子量淋巴细胞生长因子（曲曲，），由美国等人首先发现，并于年确定其编码基因结构】。该细胞因子最初是由来源于生发中心的淋巴细胞恶性肿瘤一淋巴瘤培养上清中获得，随后发现，主要是由滤泡树突状细胞（。）和活化的细胞产生。人儿基因座位于人染色体，此区经连锁分析证实为狼疮敏感性基因座，而小鼠，基因座位于第号染色体临近，和上文已提到的小鼠狼疮敏感性基因座位置相同，。人和小鼠的，基因包括个外显子和个内含子（见图），基因转录可分别从，基因的正链和负链，类似于一特异性谷氨酸脱氢酶基因（）【（如图）。，蛋白在体内可从上述两种转录物转译，且两种蛋白都具有生物活性。口代峨图基因及转录示意图等【】研究发现，体外实验中，可增强生发中心的淋巴细胞增殖，提高记忆性细胞的存活，并实验用转基因载体建立的儿转基因小鼠，结果小鼠月龄时出现高球蛋白血症，产生抗抗体等狼疮样改变。此外还证实，重组，在体外能诱导细胞产生。一与关系亦十分密切转基因小鼠可发展为狼疮样病变；一以及蛋白表达在活动期患者中显著增加。故由以上既往研究结果可以看出与有着较密切的联系。目前相关研究多仅限于美国的实验室。国内马安伦等做了，受体（）与免疫性疾病的相关研究，结果显示，在中表达显著高于正常对照组。但目前尚无有关，表达与相关研究。从本试验结果显示活动期系统性红斑狼疮患者外周血中白介素一链的表达显著高于非活动期组及正常对照组，非活动期患者链的表达与正常对照相比差异无显著性，且口链的表达与反映疾病活动性的无相关性。对比外周血中自介素一缸链的表达，活动期患者较非活动期患者有所升高，但统计学上差异无显著性，活动期患者与正常对照相比有显著升高。链的表达与无相关性。但是表达水平较高的几例均在病情活动期组统计学意义的不显著可能与病例数尚少有关。因此在这方面尚需进一步收集病例，继续观察。结合患者临床表现分析，本研究中白介素表达较高的几例在临床上均有面部蝶型红斑。二者问是否有联系尚待进一步研究证实。目前有关系统性红斑狼疮与白介素一的研究与其他白介素相比相对较少，尚无其他研究者结果可以比较。但是从基因座，生物学功能以及系统性红斑狼疮发病特点上都提示二者存在紧密联系。虽然目前研究结果尚不能直接证实是何种联系以及相关性，但进一步的研究与试验仍在继续，希望能从更深入角度探讨二者关系。结论综上所述，与关系密切，本试验显示活动期患者链的表达明显高于非活动期及正常对照，但与无相关性。高表达广的患者均有面部蝶型红斑。提示，可能参与发病过程，特别是面部红斑形成，但是进一步机制尚不明了。通过拮抗，是否可以改善病情活动，特别是面部红斑缓解，有待我们做更为大规模，更深入的分析研究，尽可能为临床治疗提供可能的新手段。参考文献，弘一，（，（一），（）一，马安伦，张冬青，王树军等，受体与免疫性疾病及白血病的关联性研究中国实验诊断学，。（）诊断标准一年，；，惦，”，），）；，），），），）。）锄印），（），（）仃啪“葛擀”。，临床积分表积分桩床表现癫痫发作近期发作，除外代谢、感染、药物因素精神症状严重的认知障碍，因而正常活动能力改变，包括幻觉，思维无连贯性、不合理、思维内容缺乏、无衔接、行为紧张、怪异、缺乏条理。除外尿毒症，药物影响器质性脑病大脑功能异常，伴定向力、记忆力或其他智力功能的损害并有波动性，包括意识模糊、对周围环境注意力不集中，加上以下至少两项认知障碍，不连贯的松散语言、嗜睡或睡眠倒错，精神运动性活动减低或亢进。除外代谢、感染，药物所致视觉障碍视网膜病变，包括絮状渗出，视网膜出血，严重的脉络膜渗出或出血及视神经炎。除外高血压、感染、药物所致颅神经病变累及颅神经的新出现的感觉、运动神经病变狼疮性头痛严重持续性头痛，可以为偏头痛，但必须对镇痛药无效脑血管意外新出现的脑血管意外。应除外动脉硬化脉管炎溃疡、坏疽、有触痛的手指小结节、甲周碎片状梗塞，出血或经活检、血管造影证实关节炎个以上关节痛和炎症体征压痛，肿胀、渗出肌炎近端肌痛或无力伴升高，或肌电图改变或活检证实管型尿、颗粒管型或管理血尿个红细胞高倍视野，除外结石，感染和其它原因蛋白尿，新出现或近期增加彬以上脓尿个白细胞，高倍视野，除外感染脱发新出现或复发的异常斑片状或弥散性脱发新出现皮疹新出现或复发的炎症性皮疹黏膜溃疡新出现或复发的口腔或鼻粘膜溃疡胸膜炎胸膜炎性胸痛伴胸膜摩擦音、渗出或胸膜肥厚心包炎心包痛及心包摩擦音或积液（心电图或超声心动检查证实）低补体、低于正常范围的最低值抗抗体滴度增高发热血小板下降低于正常范围的最低值白细胞下降几注积分对病情的判断，基本无活动；卜分，轻度活动；分中度活动；分，重度活动。，目标扩增片断分子量检索（）（）协（），（坳，（）乜（）（）（）卢一一（），（），（），（）（），（），（）科（），（），（），（）（），（），（），（）综述白细胞介素在系统性红斑狼疮中的异常表达综述杨闵审校杨南萍提要系统性红斑狼疮（）是一种多基因遗传疾病，是以淋巴细胞高度活化，产生多种自身抗体和形成多种免疫复合物而导致组织损害为特征的自身免疫性疾病。存在多种白细胞介素的异常，本文就、，等白细胞介素与相关研究做一综述。关键词系统性红斑狼疮白细胞介素；系统性红斑狼疮（，）是种以淋巴细胞与多克隆淋巴细胞异常活化为特征的多器官系统受累的自身免疫性疾病【白细胞介素（，几）作为一种重要的细胞因子参与多种非特异免疫调节与炎症反应。近年来大量研究表明，自细胞介素的异常表达对发生发展及其转归过程中有十分重要的意义。现就近年来研究热点，综述如下。白细胞介素一及其受体白细胞介素（，）为的糖蛋白，在体内主要由活化的细胞分泌，属细胞因子之一。白细胞介素受体（，）有，个亚单位，分别命名为几一（）链，链（）和，脚链。存在于细胞膜表面的称为膜白细胞介素受体（），可在酶的作用下脱落后形成血清可溶性白细胞介素受体（，）。是细胞在体外长期生长所必需的因子，它可促进活化的细胞增殖并分化成熟，诱导细胞表面的表达增加，还可刺激其它细胞因子（如、）的分泌。基因敲除小鼠的淋巴组织发育正常，但淋巴细胞过度活化，约半数小鼠在周时死于自身免疫性溶血性贫血，存活者发生与人类溃疡性结肠炎类似的疾病，而且使用治疗可减轻病情【】。这提示在免疫耐受的产生和维持中起重要作用。对与关系的研究，国外学者早在年就发现患者体外培养的淋巴细胞合成降低【年等吲研究显示患者的外周血单个核细胞在丝裂原诱导下的表达及细胞对的反应均降低，活动期更明显。患者一级亲属中，的活性也明显低于正常对照，提示，的异常表达可能与遗传因素有关，即是一种导致发生的易感因素。由于患者的细胞在无刺激原条件下培养，其的产生能力可以恢复正常【卯，提示，表达缺陷还有可能是于其它因素异常（如的高分泌）引起。年掣】进行狼疮肾炎患者尿液水平检测发现活动期患者明显高于正常对照，提出该指标可作为无创性评价患者肾脏受累程度的指标，是否有可能提示外周血低表达与排泄增多有关，尚待进一步研究。，方面，夕掣及我国刘亚光等嘲首先做了，与的相关研究，发现水平升高，且与疾病活动性相关。目前患者相关研究已成为热点。以下结论得到大多数研究者共识一活动期患者血清水平与相应血清及血沉成正相关，与含量成负相关。故曲等【提出在识别疾病活动期时最好同时检测血沉，血清及抗，若三种测定值同时升高比单独任何一种或两种测定值升高更有意义。通常高于正常值三个标准差时，常提示疾病处于活动期【埘升高患者在临床尚更容易出现心包炎和肾脏损害【】；二缓解期患者血清水平也明显高于正常人【】，故即使处于缓解期的患者仍存在淋巴细胞的异常激活，提示后续治疗和纠正机体免疫功能紊乱是必要的；三水平升高机理目前尚不清楚，可能与疾病状态下细胞数量和功能降低所致抑制功能缺陷有关，也说明了发病过程中细胞对细胞的辅助作用。白细胞介素白细胞介素一（，）是一种分子质量为的同源双体细胞因子，每个单体由个氨基酸组成。人基因定位于号染色体上，由个外显子和个内含子组成。人、淋巴细胞及单核巨噬细胞均可产生，属于型细胞因子之一。通过与受体（）结合，几从多方面发挥很重要的免疫调节作用，如抑制介导的细胞免疫而促进介导的体液免疫【，并与也一起协同促进初始细胞和效应细胞产生免疫球蛋白等。人和鼠在和氨基酸水平分别有和的同源性。人可结合人受体和鼠受体，对二者细胞都有作用，鼠只能结合鼠受体而只对鼠细胞起作用对人细胞无作用。已有许多研究已证实了在患者中是过度产生的。在对血浆水平测量中，一致明显高于健康对照组。等通过动态观测，证实了患者从疾病活动期到治疗后的血浆水平与疾病状态的联系，即水平与相关。等业已观察到患者的健康亲属有部分类似的免疫紊乱，在有多例的家族，健康个体也表现出高水平且其细胞来源相似。这也证明了是在的疾病进程中起作用而不只是发生后的副产物【”。目前，基因己被认为是的致病候选基因之一。等”研究发现患者的一、二级亲属的分泌水平比正常对照高，而且微卫星频率显著降低，而则显著升高，提示基因的异常可导致分泌水平的变化，从而影响病情。等【】还发现不但患者一级亲属的外周血单个核细胞中分泌的细胞数升高，其配偶亦较正常对照升高。因此，环境因素对分泌水平的影响亦不应忽视。年，日本学者掣】用重组的小鼠，经腹腔注射于早期代狼疮小鼠模型，发现该模型发病提前，蛋白尿等症状加重，而用抗体治疗该鼠，发现能延长其存活期，自身抗体和尿蛋白产生显著下降，肾脏病理改变明显好转，为研究在发病中的作用提供了直接证据。同年，等【】也发现重组（）可促进患者非细胞的分泌，较正常对照组增自，而抗的单抗可抑制狼疮鼠的自身抗体产生，延缓病情发展并延长生存时间。随后，年，等【用抗抗体治疗具有皮肤和关节症状的患者，结果例中有例经个月后，除了抗抗体、水平及淋巴细胞计数外，其他生物学指标均有改善。这为寻求临床治疗方法开辟了一条新的道路。白细胞介素一白细胞介素（）又称为自然杀伤细胞刺激因子叮）或细胞毒淋巴细胞成熟因子（），是白（）（）两条糖肽链共价结合而成的异二聚体，单独的具有较弱的作用，当其与共价结合后功能大为增强。，主要由单核巨噬细胞分泌产生，而细胞及其他辅助细胞仅分泌少量。生理功能是作用于淋巴细胞及细胞，可诱导早期辅助性淋巴母细胞分化成细胞并促进细胞增殖，抑制细胞分化，促进的合成及卜细胞活化。可促使某些型反应向位型反应转化，在平衡中发挥重要作用。患者的表达改变尚不明确，一部分研究者认为患者分泌水平是降低的，并非由单核细胞数量减少所引起，且与分泌水平的增高同时存在【”。患者体外分泌，的水平与血清水平、抗及呈负相关，与血