腺苷a3受体活化对大鼠脑出血继发性脑损伤炎症反应影响的实验研究

腺苷A3受体活化对大鼠脑出血继发性脑损伤炎症反应影响的实验研究硕士学位论文腺苷A3受体活化对大鼠脑出血继发性脑损伤炎症反应影响的实验研究院（系）、所临床医学院研究生姓名邓川学科、专业神经病学导师姓名唐兴江教授二一二年四月腺苷A3受体活化对大鼠脑出血继发性脑损伤炎症反应影响的实验研究摘要目的通过建立大鼠尾状核脑出血模型，并给予腺苷A3受体激动剂（CLIBMECA）活化腺苷A3受体（A3R），观察腺苷A3受体活化后对脑出血继发性脑损伤中炎性细胞（小胶质细胞、白细胞）、炎性因子（TNF）、抗炎因子（IL10）以及MMP9的影响，探讨腺苷A3受体激动剂（CLIBMECA）对脑出血后继发性脑损伤中炎症反应的影响及其保护作用。方法1采取自体血注入大鼠脑尾状核建立大鼠脑出血模型。2将90只SD大鼠随机分成三组对照组组、ICH组和治疗组，每组各30只。每组分别采取6个观察时间点，分别为术后6H、24H、2D、3D、5D和7D，每个时间点5只老鼠。3给药方法治疗组术前165MIN和术后180MIN按体重02MG/KG给予腺苷A3受体激动剂（CLIBMECA）。ICH组大鼠在术前以及术后同时间给予同剂量注射生理盐水，假手术组除不注入自体血外，其余与ICH组完全一致。4术后两小时评价模型是否成功并术后各时间点给予神经功能障碍评分。5干湿重法测定血肿周围不同时间点脑组织含水量。6放射免疫法（ELISA法）测定TNF，IL10不同时点在大鼠血肿周围脑组织中含量。7采用免疫组化以及图像分析技术观察各组不同时点血肿周围脑组织小胶质细胞、MMP9变化。8HE染色观察脑组织血肿周围白细胞数变化。结果1假手术组在脑出血术后各时间点没有神经功能障碍,无统计学差异P005；ICH组和治疗组与假手术组术后各个时间点比较，均有统计学差异（P005）；ICH组和治疗组在2D、3D与其他时间点比较有统计学差异（P005），ICH组和治疗组术后2D与3D时间点比较无统计学差异（P005）；治疗组与ICH组在脑出血术后6小时时间点比较无统计学差异（P005）,但是在24小时、2D、3D、5D以及7D时间点比较有统计学差异（P005。2假手术组脑组织含水量在各个时间点比较没有统计学意义（P005），说明假手术组在各个时间点均没有明显脑水肿发生；ICH组和治疗组术后各个时间点和假手术组比较均有统计学差异（P005）,说明ICH组、治疗组脑出血术后均有脑水肿发生；ICH组和治疗组2D和3D与其他各个时间点比较有统计学差异P005,ICH组和治疗组在术后2D与3D比较无统计学差异（P005）；治疗组和ICH组比较，在术后6小时时间点比较无统计学差异P005,但是在脑出血术后24小时、2D、3D、5D、7D时间点有统计学差异（P005）,说明治疗组在术后24小时后脑水肿有减轻。3、假手术组各个时间点脑组织TNF的含量没有明显变化，无统计学差异（P005）；ICH组和治疗组与假手术组各个时间点比较有统计学差异（P005）；ICH组脑出血术后TNF含量在术后2D和3D与其他时间点比较有统计学差异（P005）；2D与3D时间点比较无统计学差异P005；ICH组和治疗组比较在6小时时间点无统计学差异（P005）,在24小时、2D、3D、5D以及7D时间点比较有统计学差异P005。4假手术组IL10含量在不同时间点脑组织中基本无明显区别，无统计学上差异（P005）；ICH组和治疗组与假手术组脑出血术后各个时间点相比较都有统计学意义（P005）；治疗组和ICH组比较，脑出血术后各个时间点均无统计学差异（P005）。5假手术组脑组织中小胶质细胞没有明显表达；ICH组和治疗组脑组织血肿周围小胶质细胞数量与假手术组各个时点比较均有显著增多；ICH组和治疗组在术后2D和3D与其余时间点比较有统计学差异（P005）；治疗组小胶质细胞数和ICH组相比较，在脑出血术后各个时间点比较均有统计学差异（P005）。6假手术组血肿周围组织MMP9没有明显表达，统计学无明显差异（P005）；ICH组术后血肿周围MMP9数在6小时、24小时、5D、7D与2D比较，有统计学差异P005，2D与3D比较无统计学差异（P005）；治疗组和ICH组比较，在6小时、24小时、2D、3D、5D、7D时间点有统计学差异PO05）。7假手术组术后HE染色光镜观察脑细胞结构清晰完整，没有明显细胞肿胀以及核溶解核固缩；ICH组在脑出血术后各个时间点血肿周围脑组织可以见到组织充血水肿明显，有大量白细胞侵润，神经细胞变性坏死；术后随着时间点延长，血肿周围组织胶质细胞明显增多，在3D后水肿有减轻。治疗组较ICH组细胞及组织水肿程度有减轻，炎性细胞侵润有减少。结论1采用自体血注入大鼠脑出血模型方法简单，出血量易于控制，易于操作，干扰因素少，与人体脑出血的病理生理变化比较一致，是现阶段常用的脑出血模型制作方法。2脑出血后2D3D神经功能障碍最为严重，治疗组神经功能障碍较ICH组在1D后有减轻。3脑出血后血肿周围脑组织水肿明显，2D3D最为严重，治疗组较ICH组在1D后有减轻。4脑出血后血肿周围组织中TNF、MMP9、小胶质细胞以及白细胞数目在各个时间点有明显增多，在2D3D最为明显，说明它们参与了脑出血继发性脑损伤炎症反应的病理生理过程。5脑出血术后血肿周围IL10逐渐升高，腺苷A3R激动剂CLIBMECA激活A3R对IL10无明显影响。6腺苷A3R激动剂CLIBMECA激活A3R能够减轻脑出血后神经功能障碍，减轻脑出血脑组织水肿，减少脑出血后小胶质细胞激活，以及减少TNF、MMP9表达，对脑出血后继发炎症反应有减轻，具有神经保护作用。关键词腺苷A3受体激动剂；脑出血；TNF；IL10；小胶质细胞；MMP9；EXPERIMENTALRESEARCHOFARACTIVATIONEFFECTSOFBRAINDAMAGE3INFLAMMATIONREACTIONAFTERINTRACEREBRALHEMORRHAGEINRATSABSTRACTOBJECTIVETOOBSERVETHEEFFECTSOFADENOSINE3RECEPTORAR3ACTIVATIONBYRECEPTORAGONIST（CLIBMECA）ONINFLAMMATIONCELLMICROGLIA,WHITEBLOODCELLS,TUMORNECROSISFACTORALPHATNF,INTERLEUKIN10IL10ANDMMP9INBRAINDAMAGEAFTERINTRACEREBRALHEMORRHAGEICHMODELESTABLISHEDINRATSTOEXPLORETHEPROTECTIONMECHANISMANDEFFECTSOFARRECEPTORAGONIST3（CLIBMECA）METHODS1THEICHMODELWASESTABLISHEDBYAUTOLOGOUSBLOODINCAUDATENUCLEUSOFRATS290SDRATSWERERANDOMLYDIVIDEDINTOTHREEGROUPSSHAMOPERATIONGROUP,ICHGROUPANDTREATMENTGROUP,EVERGROUPHAS30RATSEACHGROUPWASOBSERVEDATSIXTIMEPOINT,WHICHWERE6H,24H,2D,3D,5DAND7DAFTERTHEOPERATIONANDATEACHTIMEPOINTFIVERATSWEREOBSERVED3DELIVERYMETHODSARRECEPTORAGONIST（CLIBMECA）ADMINISTERED3ACCORDINGTO02MG/KGFORTHETREATMENTGROUP165MINBEFOREAND180MINAFTERMODELESTABLISHEDICHGROUPWASGIVENNSATTHESAMETIME,THESHAMGROUPWASFULLYCONSISTENTWITHICHGROUP,EXCEPTINJECTEDAUTOLOGOUSBLOOD4WEJUDGEDTHEICHMODELAFTER2HASSESSMENT,ANDNEUROLOGICDEFECTGRADEWERECARRIEDOUTATEACHTIMEPOINT5THEWERESACRIFICEDTOMEASURETHEBRAINWATERCONTENTWITHWETDRYWEIGHTMETHOD6THECONTENTSOFTNF,IL10，INTHEBRAINTISSUEWEREDETECTEDWITHELISAMETHOD7WEDETECTEDMICROGLIAANDMMP9BYUSINGIMMUNOHISTOCHEMISTRYANDIMAGEANALYSISMETHOD8WHITEBLOODCELLSCHANGESOFTHECEREBRALHEMORRHAGETISSUEDETECTEDBYHESTAININGRESULT1THESHAMGROUPNERVEDYSFUNCTIONATEACHTIME,NOSIGNIFICANTDIFFERENCEP005THEICHANDTREATMENTGROUPOBVIOUSLYSTATISTICSIGNIFICANCEWITHSHAMGROUPP005ATEACHTIMEPOINTOFTHEICHANDTREATMENTGROUP,THENEUROLOGICDEFICITSAT2D、3DWASTHELOWESTWHICHWASGREATLYDIFFERENTFROMOTHERTIMEPOINTP005BETWEENTHEICHANDTREATMENTGROUPAT2D、3DWASNOSIGNIFICANTDIFFERENCEP005ATEACHTIMEPOINTOFTHETREATMENTGROUP,THENEUROLOGICDEFICITSAT24H、2D、3D、5DAND7DWEREGREATLYDIFFERENTFROMTHESHAMGROUP,EXCEPT6HAFTERPOSTOPERATIVEP0052THEBRAINWATERATEACHTIMEPOINTWERENOSIGNIFICANTDIFFERENCEP005,THEWERENOOBVIOUSBRAINEDEMAINSHAMGROUPTHEICHANDTREATMENTGROUPWEREOBVIOUSLYBRAINEDEMA,GREATLYDIFFERENTFROMSHAMGROUPATEACHTIMEPOINTP005BRAINEDEMAOFTHEICHANDTREATMENTGROUPAT2D、3DWASGREATLYDIFFERENTFROMOTHERTIMEPOINTP005BETWEENTHEICHANDTREATMENTGROUPAT2D、3DWASNOSIGNIFICANTDIFFERENCEP005ATEACHTIMEPOINTOFTHETREATMENTGROUP,AT24H、2D、3D、5DAND7DWEREGREATLYDIFFERENTFROMTHESHAMGROUP,EXCEPT6HAFTERPOSTOPERATIVEP005,ITSHOWNTHATTREATMENTCOULDREDUCECEREBRALEDEMAAFTERICH3TNFINBRAINTISSUEOFTHESHAMGROUPWASNOOBVIOUSCHANGE,NOSIGNIFICANTDIFFERENCEP005THEICHANDTREATMENTGROUPWEREGREATLYDIFFERENTFROMSHAMGROUPATEACHTIMEPOINTP005TNFOFTHEICHGROUPAT2D、3DWASGREATLYDIFFERENTFROMOTHERTIMEPOINTP005BETWEENTHE2D、3DWASNOSIGNIFICANTDIFFERENCEP005ATEACHTIMEPOINTOFTHEICHANDTREATMENTGROUP,AT24H、2D、3D、5DAND7DWEREGREATLYDIFFERENTFROMTHESHAMGROUP,EXCEPT6HAFTERPOSTOPERATIVEP0054IL10CONTENTINBRAINTISSUEOFTHESHAMGROUPWASNOOBVIOUSCHANGE,NOSIGNIFICANTDIFFERENCEP005THEICHANDTREATMENTGROUPWEREGREATLYDIFFERENTFROMSHAMGROUPATEACHTIMEPOINTP005BETWEENTHEICHANDTREATMENTGROUPATEACHTIMEPOINTWASNOSIGNIFICANTDIFFERENCEAFTERPOSTOPERATIVEP0055THEREWASNOOBVIOUSEXPRESSIONOFMICROGLIAINSHAMGROUP,ITGREATLYINCREASEDINBRAINTISSUEOFICHANDTREATMENTGROUPATEACHTIMEPOINTEXPRESSIONOFMICROGLIAOFTHEICHANDTREATMENTGROUPAT2D、3DWASGREATLYDIFFERENTFROMOTHERTIMEPOINTP005BETWEENTHEICHANDTREATMENTGROUPATEACHTIMEPOINTWASSIGNIFICANTDIFFERENCEAFTERPOSTOPERATIVEP0056THEREWASNOOBVIOUSEXPRESSIONOFMMP9INSHAMGROUP,NOSIGNIFICANTDIFFERENCEP005THEMMP9CONTENTOFICHGROUPWASGREATLYDIFFERENTBETWEEN6H、24H、5D、7DAND2DP005,BUTNODIFFERENCEBETWEEN2DAND3DP005BETWEENTHEICHANDTREATMENTGROUPATEACHTIMEPOINTWASSIGNIFICANTDIFFERENCEP0057AFTERHECOLORINGTHEBRAINCELLSSTRUCTUREISCLEARANDCOMPLETE,NOOBVIOUSCELLSWELLINGANDKARYOLYSISPYKNOSISTHEBRAINTISSUEOFICHGROUPCONGESTIONANDEDEMA,ALARGENUMBEROFWHITEBLOODCELLSINFILTRATION,NERVECELLDEGENERATIONANDNECROSISAFTERPOSTOPERATIVETHEMICROGLIAOBVIOUSLYADDEDWITHTIMELENGTHEN,THECEREBRALEDEMAREDUCEDAFTER3DINICHANDTREATMENTGROUPTHECEREBRALEDEMAANDLEUKOCYTEINFILTRATIONALSOLESSENEDCONCLUSION1THEIMPROVEDMODELOFINTRACEREBRALHEMORRHAGEICHWITHAUTOLOGOUSBLOODINRATSWHICHWASBASICALLYCONSISTENTWITHTHEHUMANINTRACEREBRALHEMORRHAGEPATHOLOGYPHYSIOLOGYCHANGE,CANBEEASILYMADEANDOPERATEDANDWITHFINEREPEATABILITYITWASACOMMONUSEDANIMALMODELTORESEARCHTHEINTRACEREBRALHEMORRHAGE2THENEUROLOGICDEFICITSSCOREAT2DAND3DWASTHELOWESTAFTERINTRACEREBRALHEMORRHAGE,THEDYSFUNCTIONOFTREATMENTGROUPWASREDUCEDAFTER1D3THEBRAINEDEMAAT2DAND3DWASTHEMOSTSERIOUS,ITWASREDUCEDAFTER1DOFTREATMENTGROUP4THEEXPRESSIONOFTNF、MMP9、MICROGLIAANDWHITEBLOODCELLSWEREOBVIOUSLYINCREASEDAT2DAND3D,ITEXPLAINTHATTHEYAREINVOLVEDINTHEPROCESSOFCEREBRALHEMORRHAGESECONDARYBRAININJURY,INFLAMMATIONPATHOPHYSIOLOGY5THEEXPRESSIONOFIL10WASADDEDAFTERCEREBRALHEMORRHAGE,THERECEPTORAGONIST（CLIBMECA）OFARWASNOSIGNIFICANTEFFECTONIL106ARACTIVATION33BYRECEPTORAGONIST（CLIBMECA）COULDREDUCETHENEUROLOGICDEFICITSSCORE,THECEREBRALEDEMAOFBRAINTISSUELESSENEDTHEACTIVATIONOFMICROGLIA,THEEXPRESSIONOFTNF、MMP9,HAVETOREDUCETHESECONDARYINFLAMMATORYRESPONSEAFTERCEREBRALHEMORRHAGE,ANDITCANPLAYANIMPORTANTROLEINNEUROPROTECTIONKEYWORDSARACTIVATIONBYRECEPTORAGONISTCEREBRALHEMORRHAGETNF3IL10MICROGLIAMMP9前言脑出血（ICH）是临床上一种常见多发的脑血管疾病，有较高的死亡率和致残率，对人民群众的健康带来极大的危害，在全世界ICH发病率为11020/10万人,在我国ICH占全部脑卒中比例约20。脑出血后继发性脑损伤主要是由于血肿本身机械性压迫神经组织从而导致周围组织局部血循环障碍以及缺血缺氧；脑出血后血脑屏障（BBB）的破坏；继发性炎症反应；补体参与免疫损伤；血肿组织中红细胞降解产物的毒性作用；活性氧过度表达等共同因素参与，这些因素之间相互促进，相互影响共同参与脑出血后继发脑损伤24。其中脑出血继发性损伤中炎症反应是重要的因素之一，由此如何减轻以及预防脑出血后炎症反应对继发性脑损伤有其重要意义。脑出血继发性脑损伤中炎症反应由炎症细胞和炎性因子相互作用的结果。炎性细胞包括脑出血血肿周围组织中的小胶质细胞、内皮细胞、星5形胶质细胞以及血液免疫系统中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等。6炎性细胞因子是由上述炎症细胞分泌以及调控产生的一种多肽，炎性细胞因子具有调控细胞的功能。炎性因子中又有促炎因子和抑炎因子。促炎因子主要有IL1、IL1、IL6、IL18以及TNF等；抑炎因子主要包括IL10、IL4和TGF等。现阶段研究显示促炎因子在脑出血继发炎症反应中的作用有是其炎症反应的启动因素以及始发因素，活化血肿周围组织炎性细胞（小胶质细胞，星形胶质细胞）有调控以及正反馈促进炎性细7胞分泌炎性因子，行成恶性循环，加重脑出血后炎症反应以及炎症损伤；具有细胞毒性，它们直接作用与神经元细胞，导致其神经细胞死亡、凋亡、8活性功能下降以及细胞水肿等；破坏脑组织结构，如刺激炎性细胞分泌910MMP9，MMP9破坏脑组织中血管基底膜,导致BBB破坏，发生脑水肿；促炎因子还有对血管内皮细胞的直接作用，致使内皮细胞功能下降等共同导致血肿周围局部组织血管通透性增高，BBB功能下降导致脑水肿以及血液中有害物质渗出，进一步刺激血肿周围神经组织。抑炎因子IL10、IL4和TGF主要作用是对机体组织起保护作用，减轻脑出血后炎症反应，调控炎症细胞使其活性下降，缓解促炎细胞因子对神经组织的毒性作用以及损伤11。小胶质细胞是在脑出血继发性损伤炎症反应中重要的炎症细胞。小胶质细胞在脑组织和脊髓中分布广泛，约占胶质细胞数目520。在正常生理情况下小胶质细胞有吞饮和迁移功能，主要是分泌以及释放生长因子以维持神经元的存活以及促进其生长分化，修复等功能；在应急如缺血缺氧、创伤等情况下小胶质细胞被激活，具有吞噬作用以及释放多种炎性细胞因子，包括IL1、TNF、IFN、TGF以及谷氨酸盐、氧自由基等细胞毒性物质，参与脑出血后炎症反应，加重继发性脑损伤12,13。腺苷（ADENOSINEADO）是内生性三磷酸腺苷（ATP）的代谢产物,是神经系统中一种重要的神经调质。在正常的生理状态下，脑组织中的ADO含量非常低，但是在病理条件下（如缺血缺氧），细胞外的ADO水平会急剧升高，与其四种受体（A1R、A2R、A2BR、A3R）参与其疾病过程，参与途径主要包括影响炎症反应、神经递质传递等。既往大量实验证明A1,A2A受体影响多巴胺、谷氨酸等神经递质的传递，发挥其对神经系统炎性损伤的保护作用1416。但是其严重副反应如低血压，心动过缓等限制其在临床中运用。近年来腺苷A3受体正逐渐受到学者的重视，现已证实腺苷A3受体活化在心肌梗死，类风湿关节炎等免疫疾病中能减轻炎症反应从而发挥保护作用，在体外研究中显示A3R参与小胶质细胞17、白细胞18、T细胞19等炎性细胞的调控，而且在脑组织中分布广泛20。但是腺苷A3受体激活在脑出血后炎症损伤中是否有保护作用目前尚没有报道。本实验建立SD大鼠自体血注入脑出血模型，采用药物腺苷A3R激动剂（CLIBMECA）激活腺苷A3R的方法，观察给予腺苷A3R激动剂激活腺苷A3R对大鼠脑出血术后各组神经功能评分、血肿周围脑组织含水量、血肿周围小胶质细胞数、MMP9表达、以及促炎症因子TNF,抑炎因子IL10变化，了解其腺苷A3R激活对脑出血继发损伤中的保护作用，为临床治疗ICH提供新的线索。材料与方法1实验材料11实验动物本实验选用成年体重在300350G之间雄性的SD大鼠，共90只。泸州医学院实验动物中心提供。动物饲养饲养环境保持饲养动物房清洁卫生，定时定期清理鼠笼，合适温度（2025摄氏度）以及湿度，分组饲养法，喂养食物条状颗粒饲料喂养以及自由摄食饮水。组实验大鼠随机分为三组假手术组、ICH组以及腺苷A3受体激动剂（CLIBMECA）治疗组，各30只。术后6H、24H、2D、3D、5D和7D共6个时间点，每个时间点5只大鼠。法治疗组腺苷A3R激动剂CLIBMECA，购于美国SIGMA公司，纯度999，按照既往文献，分2次尾静脉注射给药，分别于术前165MIN和术后180MIN，每次剂量按体重02MG/KG。ICH组大鼠在造模术前和术后采用和治疗组的相同时间点给予同剂量的生理盐水。假手术组除手术过程不注入自体血外，其余条件与ICH组保持一致。分组目的假手术组大鼠只进行和ICH组相同的手术，但是不注入大鼠自体血，其主要目的是观察手术刺激对神经功能障碍、脑水肿形成、小胶质细胞激活以及炎症反应等是否有影响，从而使其避免应激反应对实验的影响。其余两组为ICH组和治疗组，其中治疗组给予腺苷A3R激动剂CLIBMECA，通过比较以及观察腺苷A3R激动剂CLIBMECA激活A3R对脑出血继发性炎症损伤的保护作用。2主要药品和实验试剂腺苷A3R激动剂CLIBMECA，（美国SIGMA生物公司，纯度999）1戊巴比妥钠泸州医学院药理实验室提供粉剂并实验前配制兔抗MMP9免疫组化试剂盒购于武汉市博士德生物有限公司一抗兔抗鼠OX42CD11B单抗购于博士德公司一抗兔抗鼠MMP9单抗购于博士德公司二抗兔抗鼠IGG购于博士德公司鼠TNF抗体试剂盒购于北京博奥森生物有限公司鼠IL10抗体试剂盒购于北京博奥森生物有限公司PBS液、生理盐水由泸州医学院中心实验室提供3主要实验仪器WDTV型大鼠脑立体定位仪神经生物学教研室提供50UL微量注射器上海市安亭微量进样器厂显微镜BX70日本OLYMPUS手术器械剪刀、刀片、缝合针、止血钳、缝合线等泸州医学院医学试验动物中心研室提供自动组织包埋机BMZ3型超低温冰箱日本SANYO电子微量天平上海市天平仪器厂恒温烤箱上海仪器厂恒温水浴箱海门麒麟医用仪器厂石蜡切片机德国LEICA公司自动脱水机日本B150称量瓶，玻璃匀浆机D37520离心机（德国HANAU公司）IMAGEPROPLUS图像分析系统数码照相机日本OLYMPUS4实验方法41建立模型CH模型建立ICH模型建立大鼠按40MG/KG1戊巴比妥腹腔麻醉，待麻醉效果满意后大鼠俯卧于立体定向仪上，水平针牢固大鼠两侧颅骨，移动头部至正中位，门齿固定在门齿钩上，然后调整立体定向仪使其耳问线平面比门齿钩平面高24MM左右，在此方位前后囟基本处于同一平面上，常规消毒铺巾，手术刀头顶部正中皮肤切开长约8MM的皮肤纵切口，钝性分离皮下组织使其暴露充分，双氧水烧灼前囟及冠状缝，然后调整立体定向仪使其微量注射仪尖端移至向右侧中线旁开3MM前囟前02MM，骨钻钻孔并穿透颅骨，然后以75酒精消毒后，用微量注射器抽取大鼠尾静脉新鲜血液约50UL，迅速插入已钻好的颅骨孔内，向内进针06CM相当于尾状核部位，以10UL/MIN的速度向内注血，留针10MIN后缓慢退针约1分钟，颅骨钻孔以骨蜡封闭，消毒缝合头皮，手术全过程保持无菌操作。假手术组手术过程同ICH组，但不注入血液，其余操作和ICH组完一致。模型成功评价在术后2H根据GARCIA等21的评分方法进行行为检测，如下抓起鼠尾并提起高于桌面10CM，正常时大鼠前爪伸直；0级没有神经功能缺损；L级血肿对侧前肢凹收，屈曲于腹下，同侧前肢向地面伸展；2级有L级体征加俯卧于桌面时从血肿侧向对侧推大鼠时阻力降低；3级有1级体征和2级体狂大鼠行走向血肿肿对侧肢体旋转呈追尾状；神经症状达到上述L、2、3级即可以判断为模型成功。神经功能障碍评分实验动物各组分别按照相应时点按上述方法进行神经功能评分表1，最高分为18分，最低分3分。评分分数越低表明神经功能障碍越重。42取材断头取脑制作脑出血模型成功后的大鼠于实验设计对应时间点麻醉后断头取3脑，然后取血肿侧穿刺点前后各1MM脑组织，剩余大鼠脑组织用4多聚甲醛固定。脱水、包埋经过固定处理后的脑组织用清水冲洗12H，梯度乙醇脱水，氯仿，二甲苯脱酒精、浸蜡，软石蜡包埋切片制成蜡块备用。、染色大鼠脑组织用切片机切片厚为57UM，进行HE染色。43脑含水量测定在脑出血手术后各组规定时间点处死大鼠，快速取出脑组织（脑血肿侧右侧）放在定性滤纸（生理盐水湿润）的培养皿中，防止水分蒸发，取3针孔前组织约LMM称湿重，重量精确到01MG。然后再将标本置于高温烤箱（105）24小时，然后在用同一天平称干重。脑组织中含水量按ELLIOTT公式计算其含水量脑组织含水量湿重干重/湿重100。44观察血肿周围小胶质细胞和MMP9方法和步骤使用CD11B标记脑组织小胶质细胞（MG）。切片在含有O3TRITONX100的PBS液中于室温下浸泡30MIN，在行微波抗原修复。后续步骤如下加0X42（CD11B）一抗工作液1100，室温孵育时长24H；加生物素标记的相应二抗1200，室温孵育2小时，加链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物1500，室温孵育2H；然后用DAB呈色，阳性表达呈棕黄色，切片经漂洗后再脱水、透明，中性树脂封片，然后显微镜下观察；用PBS代替OX42（CD11B）一抗工作液，按上述相同方法进行免疫组化染色，再作阴性对照；上述方法染色假手术组以及ICH组，进行比较。MMP9免疫组化染色方法参考上述程序并严格按说明数执行。细胞计数在显微镜下用400倍观察血肿侧相邻5个视野区，以IMAGEPROPLUS图像分析系统计数各组各个时间点脑组织MG阳性染色的细胞数。统计结果用XS表示。45观察血肿周围白细胞变化切片在HE成功染色后，在显微镜下分别用100倍，200倍以及400倍下观察对比，照相以及记录。46测定TNF、IL10在大鼠脑组织中含量采用放射免疫法测定TNF在血肿周围脑组织中含量。步骤如下电子天平称量取出脑组织，然后再放人PBS液中去除包膜，剪刀剪碎脑组织，加入匀浆介质，在匀浆机上进行匀浆，制成10浓度即可，然后在3000R/MIN离心机上离心15分钟，留取上清液，行放射免疫法（ELISA）测定TNF、IL10含量，以上步骤严格按试剂盒上使用说明书操作。47统计学处理计量资料用均数标准差表示XS，取双侧005为检验水准，P005为有差异有显著性。多组之间比较采用单因素方差分析ONEWAYANOVA。两组间均数比较及组间两两比较采用独立样本T检验。数据结果用SPSSL30FORWINDOWS软件进行统计学处理结果1模型成功评价在本实验过程中6只大鼠死亡，ICH组治疗组有3只大鼠模型评价为0级，被排除实验，用备用大鼠进行随机替补。模型成功评价见表2TABLE2THEMODELASSESSMENTAT2HAFTEROPERATION组别0级1级2级3级假手术组10000ICH组011118治疗组0101192神经功能障碍评分大鼠脑出血术后各组不同时间点神经功能障碍评分结果见表3和图1表3术后神经功能障碍评分XSTABLE3NEUROLOGICALDYSFUNCTIONSCOREINTHEEACHGROUPPOSTOPERATIONXS组别6H24H2D3D5D7D假手术组166311317220851732083175606517630391788066ICH组1161187521685871115361337961681112213治疗组11716787316668712177809812561311436211注与假手术组比较，PO05；ICH组内各时间点与2D时间点比较PO05；与ICH组比较，PO05；治疗组内各时间点与2D时间点比较PO0520假手术组18ICH分16治疗组评14碍12障能10功8经6神4206H24H2D3D5D7D术后各时间点图1术后大鼠神经功能障碍评分XSCHART1THENEUROLOGICALDYSFUNCTIONSCOREOFEACHGROUPATDIFFERENTTIMEPOINTSINRATS从表3和图1提示假手术组在各时间点没有神经功能障碍，神经功能障碍评分基本相一致，没有统计学差异（P005）；ICH组和治疗组与假手术组各个时间点比较，均有统计学意义（P005），说明治疗组和假手术组在脑出血术后均有神经功能障碍发生；ICH组神经功能评分在脑出血术后6H、24H、5D以及7D与2D比较有统计学差异（P005），在术后3D与2D比较无统计学差异（P005），由此说明ICH组在脑出血术后神经功能障碍在2D3D达到高峰，以后时间点逐渐好转；治疗组术后神经功能评分在6H、24H、5D以及7D与2D比较有统计学差异（PO05）；在3D与2D比较无统计学差异P005，说明治疗组神经功能障碍在脑出血术后2D到3D达到高峰，在以后时间点有好转；治疗组和ICH组比较，在术后6小时时间点无统计学意义P005，但是在脑出血术后24小时2D、3D、5D以及7D时间点有统计学意义（P005），由此说明治疗组与ICH组比较，神经功能障碍在前6小时时间点没有特别差异，但是在脑出血术后24小时以后神经功能障碍较ICH组有好转。3术后含水量在血肿周围脑组织中不同时间点的动态变化脑出血术后脑组织血肿周围组织含水量在各组不同时间点的变化表4图2表4脑出血术后脑组织血肿周围组织含水量在各组不同时间点的变化XSTABLE4THECHANGSOFBRAINWATERCONTENTSINTHESHAMOPERATIONGROUP，THEICHGROUPANDTHETREATMENTGROUPPOSTOPERATIONXS组别6H24H2D3D5D7D假手术组782808678210627816061779308177730897768096ICH组823706183380838626137867812184231878148102治疗组820305682130938422111849112682671137946133注与假手术组比较，P005；与ICH组比较，P005；ICH组内各时间点与3D时间点比较，P00590假手术组88ICH组）86治疗组（84量水82含80织组78脑7674726H24H2D3D5D7D术后各时间点图2脑出血术后脑组织血肿周围组织含水量在各组不同时间点的变化XSCHAT2THECHANGSOFBRAINWATERCONTENTSINTHESHAMOPERATIONGROUP，THEICHGROUPANDTHETREATMENTGROUPPOSTOPERATIONXS表4和图2提示假手术组各时间点脑组织中含水量几乎无区别，没有统计学差异（P005），说明假手术组没有脑水肿发生；ICH组和治疗组与假手术组比较均有统计学差异（P005），提示ICH组和治疗组均有明显脑水肿发生；ICH组含水量在脑出血术后6H、24H、5D以及7D与3D比较，有统计上学差异PO05，在2D与3D比较无统计学差异（P005），由此提示脑水肿在2D到3D达高峰，以后脑水肿逐渐减轻；治疗组与ICH组比较，在6H时无统计学差异（P005），在24小时、2D、3D、5D以及7D的时间点有统计学差异（P005），说明治疗组与ICH组比较在术后前1D血肿周围脑水肿没有明显差异，但是治疗组在术后24小时后脑水肿有减轻。4术后TNF含量在血肿周围脑组织中动态变化术后各组TNF含量在不同时间点血肿周围脑组织中动态变化见表5和图3表5术后各组TNF含量在不同时间点血肿周围脑组织中动态变化NG/M1XSTABLE5THECHANGSOFTNFINTHESHAMOPERATIONGROUP，THEICHGROUPANDTHETREATMENTGROUPPOSTOPERATIONNG/M1XS组别6H24H2D3D5D7D假手术组137003134002131005132002135002132003ICH183003209008223012203011183012176009治疗组182006189013206016192009171018161017注与假手术组比较，P005；与ICH组比较，PO05；ICH组内各时间点与2D时间点比较，P00525假手术组ICH组2治疗组量含15F1NT0506H24H2D3D5D7D术后各时间点图3术后各组TNF含量在不同时间点血肿周围脑组织中动态变化NG/M1XSTABLE3THECHANGSOFTNFINTHESHAMOPERATIONGROUP，THEICHGROUPANDTHETREATMENTGROUPPOSTOPERATIONNG/M1XS从表5和图3提示在假手术组TNF含量在不同时间点脑组织中基本无明显区别，无统计学上差异（P005）,说明假手术组在术后TNF没有明显变化；ICH组血肿周围脑组织中TNF的含量在术后6H、24H、3D、5D、7D与2D比较有统计学差异PO05，由此提示在脑出血术后TNF的含量在血肿周围组织中2D增高最为明显，在以后逐渐下降；ICH组和治疗组与假手术组脑出血术后各个时间点相比较都有统计学意义（P005），由此说明治疗组以及ICH组脑出血术后TNF表达有明显升高；治疗组和ICH组比较，在脑出血术后6小时无统计学意义（P005）,但是在术后24小时、2D、3D、5D以及7D时间点都有统计学差异（P005），由此说明治疗组在脑出血术后血肿周围脑组织中TNF较ICH组表达在6小时时间点没有差异，在24小时后治疗组中TNF较ICH组有减少。4术后IL10含量在血肿周围脑组织中动态变化术后各组IL10含量在不同时间点血肿周围脑组织中动态变化见表6和图4表6术后各组TNF含量在不同时间点血肿周围脑组织中动态变化PG/MGXSTABLE6THECHANGSOFIL10INTHESHAMOPERATIONGROUP，THEICHGROUPANDTHETREATMENTGROUPPOSTOPERATIONPG/MGXS组别6H24H2D3D5D7D假手术组6011989612389959779336178821617798759331128ICH组666911337989113888710239633112011329105612132116治疗组63881222781213238998145598221367111231236123661329注与假手术组比较，P005160假手术组140ICH组）治疗组G120M/G100P（量80含6001L40I2006H24H2D3D5D7D术后各时间点图4术后各组IL10含量在不同时间点血肿周围脑组织中动态变化PG/MGXSCHAT4THECHANGSOFIL10INTHESHAMOPERATIONGROUP，THEICHGROUPANDTHETREATMENTGROUPPOSTOPERATIONPG/MGXS从表6图4提示在假手术组IL10含量在不同时间点脑组织中基本无明显区别，无统计学上差异（P005）；ICH组和治疗组与假手术组脑出血术后各个时间点相比较都有统计学意义（P005），由此说明治疗组以及ICH组脑出血术后IL10表达有明显升高,随着时间点的延长，ICH组和治疗组中IL10升高越显著；治疗组和ICH组比较，脑出血术后各个时间点均无统计学差异（P005），由此说明治疗组脑出血术后各个时间点IL10含量与ICH组无明显差异。5血肿周围小胶质细胞变化通过免疫组化观察术后各组小胶质细胞（MG）数变化，小胶质细胞经OX42标记阳性细胞核呈棕黄色。在假手术组术后各个时间点未见有OX42标记阳性小胶质细胞细胞；ICH组在6小时看见少量OX42着色小胶质细胞，但是细胞形态不完整以及数量比较少起。在24H时OX42数量上已有明显增多，形态上呈圆形、椭圆型少数呈梭型。到2D时数量最多，体积较前明显有所增大。2D以后数量上逐渐减少，在7D时仍可见少量表达；治疗组和ICH组比较，治疗组的OX42表达程度较ICH组有明显减轻见图。图5ICH组6HMG表达400倍图6治疗组6HMG表达400倍图7ICH组24HMG表达400倍图8治疗组24HMG表达400倍图9ICH组2DMG表达400倍图10治疗组2DMG表达400倍图11ICH组3DMG表达400倍图12ICH组3DMG表达400倍图13ICH组5DMG表达400倍图14ICH组5DMG表达400倍图15ICH组7DMG表达400倍图16ICH组7DMG表达400倍各组术后MG含量变化在不同时间点血肿周围脑组织中动态变化见表7和图17表7各时间点MG数量含量的变化XSTABLE7THECHANGSOFMICROGLIALCELLSINTHESHAMOPERATIONGROUP，THEICHGROUPANDTHETREATMENTGROUPPOSTOPERATIONXS组别6H24H2D3D5D7D假手术组000000ICH组1863634738677356932615656750327651583312治疗组153338356732566378849737983321813101324注治疗组与ICH组比较，PO05；ICH组内其余各时问点与2D时间点比较，P005。90ICH组80）70治疗组个（60数50胞细40质30胶小201006H24H2D3D5D7D术后各时间点图17各时间点MG数量含量的变化XSCHAT17THECHANGSOFMICROGLIALCELLSINTHESHAMOPERATIONGROUP，THEICHGROUPANDTHETREATMENTGROUPPOSTOPERATIONXS从表7和图17显示在假手术组各时间点没发现明显激活的MG，说明在正常情况下脑组织中小胶质细胞几乎没有被激活；ICH组血肿周围MG在术后6H时间点就有表达，说明ICH后血肿周围脑组织MG有被激活，在6H后逐渐升高，在6H、24H、3D、5D以及7D与2D时间点相比较，有统计学差异（P005），由此说明ICH术后MG数量在2D达高峰，以后逐渐减少，在7天时仍有少量表达；在治疗组和ICH组比较6小时、24小时、2D、3D、5D、7D时间点均有统计学差异（PO05），由此说明治疗组术后血肿周围脑组织中MG数量上较ICH组有减少。8大鼠大脑半球出血侧血肿周围脑组织中MMP9表达变化MMP9免疫组化阳性表达细胞胞浆呈棕黄色颗粒，强阳性呈黄色以及团块状物质，主要在血管周围内皮细胞，星形胶质细胞，在血肿组织中也有表达。假手术组脑组织中MMP9仅有少量表达，ICH组在6H时MMP9开始有少量表达，但细胞着色较浅，数量较少，在24H时MMP9表达有增多，到2D时间点数量上有明显增多，着色较深，呈颗粒状或团块状。2D后MMP9表达逐渐减少，7D时间点仍有少量表达，在治疗组血肿周围脑组织中MMP9表达趋势上和ICH组没有明显区别，但是数量上有减少以及着色较浅。图18ICH组6HMMP9表达400倍图19治疗组组6HMMP9表达400倍图20ICH组24HMMP9表达400倍图21治疗组24HMMP9表达400倍图22ICH组2DMMP9表达400倍图23治疗组2DMMP9表达400倍图24ICH组3DMMP9表达400倍图25治疗组2DMMP9表达400倍图26ICH组5DMMP9表达400倍图27治疗组5DMMP9表达400倍图28ICH组7DMMP9表达400倍图29治疗组7DMMP9表达400倍表8各组术后不同时间点大鼠脑组织血肿周围MMP9阳性表达的数量XSTABLE8THEEXPRESSIONOFMMP9POSITIVECELLSINEACHGROUPRATATEACHTIMEPOINTXS组别6H24H2D3D5D7D假手术组623063778121587129678163576132588165ICH组30336324156523816766575797676332512567583治疗组233891132021112716813146923989528610314803936注ICH组术后各个时间与2D比较，P005；治疗组与ICH组各个时间点比较，P005；治疗组各时间点与2D比较，P005100假手术组90ICH组）80治疗组个70（数60性50阳409P30MM201006H24H2D3D5D7D术后各时间点图30ICH组，治疗组术后各个时间点血肿周围脑组织中MMP9阳性表达的变化SXCHART30THEEXPRESSIONOFMMP9POSITIVECELLSINTHEICHGROUPAND