醋酸甲羟孕酮诱导结肠癌sw480细胞凋亡及其差异表达蛋白分析

1密级重庆医科大学硕士学位论文醋酸甲羟孕酮诱导结肠癌SW480细胞凋亡及其差异表达蛋白分析论文题目作者姓名堂堕指导教师姓名职称、单位名称邱宗荫教授药物分析学士学科、专业名称硕申请学位级别论文答辩年月2010年5月20LO年5月本人申明所呈究成果据我所知人已经发表或撰写的学位或证书而使在论文中作了明确申请学位论文学位论文本人完全了解位期间论文工作的文或使用论文工作部门或机构送交论位论文的全部或部存论文目录英汉缩略语名词对照。L中文摘要3英文摘要5论文正文醋酸甲羟孕酮诱导结肠癌SW480细胞凋亡及其差异表达蛋白分析8前言8第一部分醋酸甲羟孕酮对人结肠癌细胞SW480增殖和凋亡的影响10O1材料和方法12结果。133讨论19第二部分醋酸甲羟孕酮诱导SW480细胞凋亡前后的比较蛋白质组学分析211材料和方法。222结果。263讨论30全文总结33参考文献34文献综述。37至I【谢。49硕士期间发表的论文。50至壅垦型奎堂堡圭堡壅生兰堡鲨兰一一英汉缩略语名词对照中文全称英文全称英文缩写AT595NM595NM吸光度ABSORBANCEA595乙腈ACETONITRILEACN过硫酸铵AMMONIUMPERSULFATEAPALBUMIN牛血清白蛋白BOVINESERUMBSA乙醇胺丙基二甲胺DIMETHYLAMINOCHOLAMIDOPROPYLCHAPS基丙磺酸盐PROPANESULFONATECOLORECTALCANCER结肠癌CRCTWODIMENSIONAL双向电泳ELECTROPHORESIS2DE二甲基亚砜SLALFOXIDEDIMETHYLDMSO二硫苏糖醇DITHIOTHREITOLDTTTETRAACETICACIDDIAMINE乙二胺四乙酸ETHYLENEEDLA流式细胞分析FLOWCYTOMETRICANALYSISFCAIO，FLUORESCEIN异硫氰酸荧光素ISOTHIOCYANATEFLTC克GRAMG小时HHOLXR液相色谱芯片质谱LIQUIDHIGHPERFORMANCEHPLCCHIPMSPECTROMETRYCHROMATOGRAPHYCHIPMASSSIODOACETAMIDE碘乙酰胺IAA等电聚焦ISOELECTROFOCUSINGIEFIMMOBILIZED固定PH梯度GRADIENTPHIPG千道尔顿KILODALTONKDMOLE摩尔每升PER1ITERM毫克MIILIGRATIAMG分钟MINMINLATEMILLILITER毫升ML重庆医科大学硕士研究生学位论文MOLMOLE摩尔ACETATE醋酸甲羟孕酮MEDROXYPROGESTERONE慨四甲基偶氮唑盐34，5一DIMETHYLTHIAZOL一2Y1一5DIPHENYLMTTTETRAZOLIUMBROMIDESERUMNEONATALBOVINE小牛血清GROUPNBSOD光密度DENSITYOPTICALPBSBUFFEREDSALINE磷酸盐缓冲液PHOSPHATEOF酸碱度PHPOTENTIALHYDROGENPIIODIDE碘化丙啶PROPIDIUMREVOLUTIONSMINUTERMINPER每分转数ROOSEVELTMEMORIALINSTITUERPMLL640培养基PARKRPMIL640SECOND秒SSDSSODIUMSULPHATE十二烷基硫酸钠DODECYLSDSPAGESODIUMSULFATEDODECYLPOLYACRYLAMIDEGEL十二烷基硫酸钠聚ELECTROPHERESIS丙烯酰胺凝胶电泳TEMED四甲基乙二胺TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE嘶S三羟甲氨基甲烷TRISHYDROXYMETHYLAMINOMETHANEVVOLT伏特VHVOLTHOUR伏特小时嵋微克MICROGRAMMEMICROLITRE止微升MICROMOLE州微摩尔2重庆医科大学硕士研究生学位论文醋酸甲羟孕酮诱导结肠癌SW480细胞凋亡及其差异表达蛋白分析摘要目的ACETATE，MPA诱导的建立醋酸甲羟孕酮MEDROXYPROGESTERONE人结肠癌SW480细胞凋亡模型，运用比较蛋白质组学分析鉴定细胞凋亡前后的差异表达蛋白质，从蛋白表达水平为进一步阐明MPA诱导结肠癌细胞发生凋亡的机理提供新的实验依据。方法1采用醋酸甲羟孕酮诱导SW480细胞凋亡。通过MTT、流式细胞技术分析细胞抑制率，选择合适的药物浓度和诱导时间；透射电子显微镜观察用药前后亚细胞结构的改变、细胞周期和凋亡检测对凋亡结果进行验证，构建凋亡模型。2采用双向电泳技术分离MPA处理组和对照组SW480细胞全蛋前后的差异蛋白点，胰酶酶解，HPLCCHIPMS在线分析、鉴定差异表达蛋白点。差异表达蛋白，生物信息学分析，得到差异蛋白的相关肽段的MSMS质谱图。重庆医科大学硕士研究生学位论文结果1不同浓度的MPA对结肠癌SW480细胞的增殖有明显的抑制和诱LAMOLL。细胞周期分析表明MPA诱导凋亡作用，半数抑制浓度约为50导结肠癌细胞凋亡的作用可能与细胞周期的阻滞相关，此阻滞作用具LAMOLLMPA处理细胞48H后，透射电镜观察可见有剂量依赖性。50细胞核固缩、碎裂，染色质高度浓缩，并出现趋边凝集，有大量凋亡小体形成。软件比对，筛选5个表达有差异的蛋白斑点，HPLCCHIPMS分析鉴定，发现有2个蛋白在凋亡组表达上调，5个蛋白在凋亡组下凋。分别是22MEMBER11、UCHL2、10，SOLUTECARRIERFAMILYUBIQUITIN，LM03，HSPNDPKA、LAMININ1等7种SW480细胞凋亡相关蛋白。RECEPTOR结论MPA可诱导人结肠癌SW480细胞发生凋亡，其作用可能与细胞周期的阻滞相关。所鉴定出的7种差异蛋白可能作为MPA抗结肠癌的潜在生物标志物，在凋亡途径中起着重要作用。关键词醋酸甲羟孕酮，SW480，细胞凋亡，双向凝胶电泳，HPLCCHIPMS4重庆医科大学硕士研究生学位论文MEDROXYPROGESTERONEANDSW480CELLAPOPTOSISCOLONCANCERANALYSISEXPRESSIONPROTEINDLFFERENTIALABSTRACTOBJECTIVESTREATEDMODELTHATSW480AREWITHTOESTABLISHTHEAPOPTOSISINADDITION，TOINVESTIGATECHANGESACETATEMPAINMEDROXYPROGESTERONECELLSMPATREATEDWITHOFSW480THECOMPARATIVEPROTEINSPECTRUMEVIDENCETOFURTHERANDNEWRESEARCHEXPERIMENTALPROVIDEPROTEOMECELLFROMMECHANISMOFMPAMEDIATEDELUCIDATETHEAPOPTOSISPROTEINMOLECULARLEVELMETHODSWERETREATEDWITHMPAINDUCEDTOBE1SW480CELLSAPOPTOSISMTTRATEINTODETECTTHESW480CELLSINHIBITIONFLOWWEREUSEDANDCYTOMETRYTIMETOTHECONCENTRATIONANDINDUCTIONORDERTOSELECTDRUGAPPROPRIATES缸UCTLLIEINSW480TRANSMISSIONTHEONSUBCELLULAROBSERVECHANGESBYANDTREATMENTWITHMPACELLELECTRONBEFOREANDAFTERCYCLEMICROSCOPETHETREATEDSW480WEREOFDETECTIONUSEDTOVERIFYAPOPTOSISAPOPTOSISTHEESTABLISHMODEKCELLS，TOAPOPTOSISCELLSINANDOFSW480MPATREATEDCONTROL2WEPROTEINSSEPARATED重庆医科大学硕士研究生学位论文2DETHETWODIMENSIONALIMAGESGELELECTROPHORESIS2DEANDGROUPBYDIFFERENTIAWITHWEREDIGESTEDPDQUEST80SOFTWARETRYPSINANALYZEDWASOFSW480CELLSTREATEDANDUNTREATEDHPLCCHIPMSSPOTSPROTEINANDTOONLINEEXPRESSEDPROTEINANALYZEINDENTIFYDIFFERENTIALLYADOPTEDFORTHE3MASCOTSOFTWAREWASUSEDTOSEARCHDIFFERENTIALLYEXPRESSEDCANINGAINANALYSISPROTEINSOFFROMMSMSPROTEINSSPECTRUMPEPTIDEDIFFERENTIALLYEXPRESSEDRESULTSWAS1THEOFSW480CELLSINHIBITED，ANDSIGNIFICANTLYPROLIFERATIONCONCENTRATIONSOFMPATHEWASINDUCEDDIFFERENTSW480BYCELLAPOPTOSISWASABOUT50LAMOLLCELLCYCLEIC5050INHIBITORYCONCENTRATIONDOSEINCELLBETHATTHEMPAINDUCEDSW480INDICATEDAPOPTOSISMAYANALYSISINWASARELATEDTOCELLARRESTRELATED，WHICHCYCLE50LJMOLLFORSW480CELLSTREATED48H，NUCLEARBYDEPENDENTAFTERANDCONDENSATION，AGGREGATIONCONDENSATION，FRAGMENTATION，CHROMATINWASOBSERVEDUNDERINTRANSMISSIONELECTRONICALOTOFBODIESAPOPTOTICMICROSCOPEINOF2DE5DIFFERENTIAIMAGES2SCREENINGPROTEINSPOTSANALYSISWEREWITHUSEDCONTROL，2PROTEINSBYPDQUESTSOFTWARECOMPARED7OFSW480CELLWHILE5WEREKINDSDOWNREGULATEDTHEUPREGULATEDIDENTIFIEDHAVEBEENBYAPOPTOSISRELATEDPROTEINSCARRIER22MEMBER11，10，SOLUTEWEREFAMILYUBIQUITIN，LM03，HSP6重庆医科大学硕士研究生学位论文LRRI“12、NDPKA、LAMININUCHLRECEPTORCONCLUSIONSWHICHISRELATEDMPACANINDUCEHOMOSW480CELLPOSSIBLEAPOPTOSISOFCELL7IDENTIFIEDINTOARRESTDIFFERENTIALYPROTEINSCYCLETHEEXPRESSEDASMPAANTICOLONCANCEL“BIOMARKERSANDTHISSERVESTUDYMAYPOTENTIALINCELLROLESMPAMEDIATEDVERYAPOPTOSISPLAYIMPORTANTACETATE，SW480，CELLKEYWORDSMEDROXYPROGESTERONEAPOPTOSIS，TWODIMENSIONALGELELECTROPHORESIS，HPLCCHIPMS7重庆医科大学硕士研究生学位论文醋酸甲羟孕酮诱导结肠癌SW480细胞凋亡及其差异表达蛋白分析前言结肠癌CRC是世界范围内第二大癌症杀手，也是最普遍的一种疾病之一。特别是在新加坡、美国等发达国家，其死亡率和发病率非常高1L。近年来，在新加坡，结肠癌作为世界上最为普遍的恶性肿瘤已经超过了肺癌。自从被发现诊断确诊时，大约百分之五十的病人在五年之内都发生了肿瘤转移至肺或肝脏，而大多数病人都是死于结肠癌的转移。据报道，遗传因素导致这种疾病的发生率为百分之二十，而外源性因素导致这种疾病的发生率却是百分之八十，根据流行病学揭示出，这种疾病的发生跟低纤维饮食有关，过低的纤维吸收会增加结肠癌的发病率121。也就是说这种疾病的发生密切跟饮食相关。当今的结肠癌检测在临床方面的应用为大便潜血FOBT，结肠镜检查术【3J，这些技术已经大大的降低了死亡率。然而虽然有这些检测技术，但是百分之七十的检测都是应用于癌症晚期，预示着不可信的诊断结果。如果结肠癌在早期阶段能够被检测到，那么百分之九十的病人依靠外科手术是可以治愈的。因此早期的诊断对控制结肠癌的发病率是非常重要的。随着人类基因组计划HGP的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。近年来，蛋白质组学作为这一时代的重要支柱在研究细胞的增殖，分化，异常转化，肿瘤细胞形成，凋亡等方面进行了有力的探索，包括其在直结肠癌，肝癌，胃癌，白血病，前列腺癌，乳腺癌等不同器官系统的研究。另外，鉴定了一批肿瘤相关蛋白，为肿瘤的早期诊断，药靶的发现，疗效和预后的判断提供了重要依据14,51。早期的检测对癌症的控制和预防是非常重要的，生物标志物在这个过程中提供了关于细胞在任何时刻状态有价值的信息。当细胞从非疾病状态转化成为新生肿瘤物时，这种显著性的改变可以通过恰当的生物标志物被潜在地检测到。而这种生物标记物的研究得益于蛋白质组学技术的提高。目前，蛋白质组学研究的核心技术仍然是双向凝胶电泳20PAGE质谱MS技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。事实上，蛋白质组学方法在发现新的癌症标志物和治疗药物靶标已经成为一个8重庆医科大学硕士研究生学位论文新兴的工具61，这种技术方法同样应用于结肠癌靶标的鉴别中791本研究以人结肠癌SW480细胞为研究对象，旨在通过药物干预作用于癌细胞，诱导其发生凋亡，通过研究细胞凋亡前后蛋白质表达的变化，寻找与凋亡相关的结肠癌生物标志物，从中筛选出肿瘤治疗新的药物靶点。主要研究内容1构建醋酸甲羟孕酮诱导SW480结肠癌细胞凋亡模型2双向电泳分离药物处理组和未处理组样品3HPLCCHIPMS分析鉴定凋亡前后的差异蛋白，并进行后续生物信息学分析。技术路线如下9重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分醋酸甲羟孕酮对人结肠癌细胞SW480增殖和凋亡的影响醋酸甲羟孕酮，为孕激素类药物。它作为一种天然类固醇黄体酮的合成衍生物，主要应用于妇科疾病的治疗。我国于上个世纪八十年代开始使用，经过几十年的临床实践，醋酸甲羟孕酮除了可用于与激素相关的肿瘤内分泌治疗外，如乳腺癌和子宫内膜癌；同时作为治疗非激素敏感性肿瘤的辅助用药，应用于癌症恶病质及引起的厌食症ILOL。同时，它对减少结肠癌的发病率方面也具有重要意义F111。YOSHIHIRO16细胞的增殖效应进行了相TANADA,MDTL21等对MPA作用于HT29和HCTI结肠癌细胞的增殖，对细胞周期相关蛋白质的调节表达PR和或AR蛋白并促成CDK2曾做过醋酸甲羟孕酮对结肠癌的研究，王伟军等131人探讨了醋酸甲羟孕酮对LSL74T结肠癌细胞的增殖和凋亡的影响，其结果同样也表明了A的抗癌机制可能于与阻滞细胞周期的有序运行有关。同时该研究还有另一个重要结果，即脚A的促调亡机制与诱导FAS表达有关。目前已建系的肠癌细胞株有近百种，其中，LSHCT116及HCT8等人结肠癌细胞被各种研究广泛使用，而这些细胞系在长期传代培养中受多种因素的影响可能导致细胞表现出遗传学的不稳定性，实验结果也因此会受到影响。如王立峰等人的研究工作发现【141，不同结肠癌细胞株的CEA表达情况不尽相同，这种细胞株CEA表达特性的不同有可能影响其体外生物学行为，提示需要选择不同的结肠癌细胞株来考察药物的作用规律。为此，我们选择另一种低分化SW480细胞，研究MPA对癌细胞的增殖和诱导凋亡作用，旨在为全面了解其作用机制提供新的实验依据。1材料和方法11材料111细胞培养材料及来源10重庆医科大学硕士研究生学位论文SW480人结肠癌细胞中国科学院上海生命科学研究所RPIML640培养基美国GIBCOBRL公司小牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司胰蛋白酶SIGMA公司112主要试剂及来源MPA醋酸甲羟孕酮SIGMA公司DMSO二甲亚砜SIGMA公司MTTSIGMA公司ANNEXINVFITC试剂盒深圳晶美公司戊二醛重庆医科大学电镜实验室113主要仪器及来源苏净集团安泰公司超净工作台二氧化碳细胞培养箱德国HERAEUS公司倒置显微镜重庆光学仪器厂550型酶标仪美国BIORAD公司德国HERAEUS公司恒温水浴箱HITACHI600透射电子显微镜日本日立公司流式细胞仪德国HERAEUS公司德国HERAEUS公司BIOFUGEPIEO型离心机80低温冰箱日本OSTAR显微镜照相系统日本OLYUS114主要试剂配制称取NAHC03209，加双蒸水800ML，磁力搅拌器搅拌3H，浓盐酸调PH值至7274，双蒸水定容到1000ML。另外，加蒸馏水于青霉素和链霉素中，使其在培养液中的最终浓度均为100单位ML，滤罐经高压消毒后抽滤分装为90ML瓶，共10瓶。四重庆医科大学硕士研究生学位论文RAIN，分装，20。C保存。临用前，加入10ML小牛血季清小牛血清，56“C灭活301640培养液。清配成含10的RPMI能溶解，022PRO滤膜抽滤除菌，4。C保存。3含不同浓度的醋酸甲羟孕酮RPIML640液体培养基称取19326MGUMOLL、50UMOLL、75PMOLL的药物培养液。成终浓度分别为25搅拌混匀，4“C冰箱过夜避光保存。次日，022PRO微孔滤膜过滤，小剂量分装，一20。C冰箱长期保存。12方法121细胞培养用含有10小牛血清的RPMI1640培养液，于37、5C02饱和湿度的培EDTA的消化液传代细胞。122MTT实验测细胞增殖抑制率将SW480癌细胞置37“2、5C02饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期的细胞用消化液消化传代。收集细胞，加入到96孔培养板中，每孔100010000PMOLL、75IIMOLL个细胞，培养24H后换液，加入含不同浓度25PMOLL、50的醋酸甲羟孕酮RPIML640液体培养基，每个浓度设四个复孔，另设调零孔、溶ULMTT，剂对照孔和对照孔。分别于药物处理24H、48H、72H后，向每孔加入20L，振荡10RAIN，使蓝色结晶物溶解培养4小时后，吸走上清，再加入DMS0100P酶标仪测定492NM处各孔的OD值，重复3次，取平均值。细胞抑制率按公式计算细胞抑制率1，实验组OD值对照组OD值100。123统计学处理12重庆医科大学硕士研究生学位论文WINDOWS各组试验数据以平均值士标准差士S表示，采用SPSS130软件ONEWAYANOVA方式行方差分析，两两比较采用STUDENTT检验，统计学意义显著性标准设定为005。试验重复3遍以上。124倒置显微镜观察细胞形态对照组不加醋酸甲羟孕酮的SW480细胞。处理组50PMOLL、75LAMOLL的醋酸甲羟孕酮作用于对数生长期的细胞，倒置显微镜下观察细胞的形态学特点及生长情况。125透射电镜观察SW480细胞结构的改变透射电镜观察处理与未处理的结肠癌细胞的超微结构图。其操作为收集经50LA离心，弃去上清。用25戊二醛固定，L锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅铀双重染色，观察并拍照。126流式细胞仪测定SW480细胞凋亡及细胞周期各时相的变化在100ML的培养瓶中待SW480细胞长满融合瓶底的6070时，加入上述各浓度的MPA培养液，培养48H，再设置一个溶剂处理的对照组细胞和一个空白对照组细胞。另外，再用半数抑制浓度的MPA作用肿瘤细胞24小时，分别收集粘附和漂浮的SW480细胞制成单细胞悬液，PBS洗二次，调整细胞数为L106个ML，按上述操作另取经过相同处理的2106个细胞，PBS洗二次，70的乙醇固定。以异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白VFITCANNEXINV联合碘化丙啶PI，IODIDE染色双参数技术，按照试剂盒说明书的操作方法，定量检测PROPIDIUMSW480细胞凋亡及细胞周期各时相的百分比。所有的实验重复二次。以FITC和CELLPI荧光作双参数点图，FACSTATIONRUNNINGQUEST软件分析DNA含量。计数4群细胞比例。2结果21醋酸甲羟孕酮对SW480细胞增殖的抑制作用13重庆医科大学硕士研究生学位论文空白对照组与实验组的结果表明，加入MPA后，人结肠癌SW480细胞的增殖数量明显降低，且随着浓度的增大，细胞数量下降的程度更加明显；MPA作用增殖的抑制率趋于稳定图1。其差异均具有统计学意义PO05。上述结果说UM01IJL图1BLPA对结肠癌SW480细胞增殖抑制的剂量依赖关系MPACANCERINONTHEOFCOLONSW480CELLSAINHIBITIONFIG1PROLIFERATIONDOSEDEPENDENT22醋酸甲羟孕酮对SW480细胞形态学观察倒置显微镜未经处理的SW480细胞呈单层贴壁生长，不规则，有些视野可呈细胞集落聚集生长，细胞核大，有个别细胞脱落，未贴壁，总体生长状态良好，细胞整体轮廓清晰。从图中可看到胞突呈尖细的纤维母细胞样双极细胞，中间细胞核为圆形LAMOLLI，50UMOILT，75的类圆形细胞，以及有尖细胞质的单极细胞。经25LA胞大量脱落，有黑色的颗粒样物质，细胞体积和细胞数量减小，皱缩，细胞形态显著发生变化，胞浆混浊，培养液中有大量的细胞碎片。14重庆医科大学硕士研究生学位论文CONTROLGROUP75LLMOLL48H50LLMOLL48H图2倒王显微镜下观察正常及经不同浓度MPA处理的SW4踟结肠癌细胞CANCERSW480TREATEDWITHDIFFERENTTHEEFFECTOFCOLORECTALCELLFIG2MPAOBSERVEDINVERTCONCENTRATIONBYMICROSCOPE23透射电镜观察对照组的结肠癌细胞超微结构表现为有丝分裂时高核质比特性，细胞呈不规则的多角形，细胞膜完整，细胞核大，核仁明显，核染色质均匀地分布在核内，表面附着丰富的微绒毛，内染色质丰富，无明显染色质聚集。而SW480细胞经浓度为50UM01L的MPA作用48小时后可见细胞形态发生明显的变化，细胞核固缩、碎裂，染色质高度浓缩，并出现趋边凝集，有大量凋亡小体形成。图315重庆医科大学硕士研究生学位论文图3透射电子显微镜观察SW480细胞的凋亡A对照组，未加药物干预；B处理组，经卯PMOLLMPA作用48HTRANSMISSIONELECTRONOBSERVATIONOFFIG3MICROSCOPYAPOPTOSISINMPATREATEDSW锏；0CELLACONTROLWITHS、7舳CELLS，UNTREATEDM呼A；50BTHESW480CELLSTREATEDWITHUMOLLMPAFBR锅H24醋酸甲羟孕酮诱导的SW480细胞凋亡及对细胞周期的影响鉴于MPA对结肠癌细胞SW480所表现出的生长抑制效应，我们进一步对不同浓度的MPA诱导SW480结肠癌细胞的凋亡情况进行了考察。流式细胞术的分LAILM01L。处理组的细胞凋亡率为332，48H、50MOLL以处理组的细胞凋亡率为360L，48H、751TM01LD处理组细胞的凋亡率为5615，结果表明，随着MPA浓度的递增，SW480的凋亡率在处理48小时后随之增加，统计学具有显著差异。P005见图4。16重庆医科大学硕士研究生学位论文2竹2“王2P2拿L竹。一YFLLU75MODL空白对照组溶剂对照组25MOLLMPA组50P蛳HMPA组PMPA组图4流式细胞术FITCANNEXINV，PL洪检测MPA对SW480细胞凋亡的作用VVFITCFITCPL区燃伤细胞ANNEXINL；2区凋亡晚期或坏死细胞ANNEXINPI011THEMPATHEROLEOFINSW480CELLSDETECTEDFLOWBYCYTOMETRYN孚4APOPTOSISVPIDOUBLEFI