毕业论文-生物催化法生产r-扁桃酸及其年产500吨规模的工厂工艺设计

硕士学位论文论文题目生物催化法生产R扁桃酸及其年产500吨规模的工厂工艺设计作者姓名沈祝飞指导教师郑裕国教授薛亚平副教授学科专业生物工程所在学院生环学院提交日期2013年5月BIOCATALYTICSYNTHESISOFRMANDELICACIDANDPROCESSDESIGNOF500T/ASCALESUBMITTEDTOZHEJIANGUNIVERSITYOFTECHNOLOGYFORMASTERDEGREEWRITTENBYSHENZHUFEIMAJORINGINBIOLOGICALENGINEERINGSUPERVISEDBYPROFESSORZHENGYUGUOCOLLEGEOFBIOLOGICALANDENVIRONMENTALENGINEERINGOFZHEJIANGUNIVERSITYOFTECHNOLOGYMAY,2013目录摘要IABSTRACTIII第一章文献综述111简介112RMA的工业合成方法213生物催化法合成RMA6131脂肪酶法生物催化合成RMA6132氧化还原酶催化合成RMA7133腈水解酶催化合成RMA814腈水解酶研究概况915生物制药过程放大研究进展12151生物制药工艺设计12152生物工程优化与放大12153生物反应器设计1416本论文的研究目的与内容15第二章生物催化法生产RMA小试试验工艺研究1621发酵产酶工段工艺17211材料和方法172111菌株172112培养基172113菌种培养条件182114生物量测定182115腈水解酶活力测定19212诱导剂的选择19213发酵温度优化20214最优条件下5L发酵罐中培养21215PH连续调控对产酶的影响22216补加甘油对产酶的影响23217小结2422不对称水解工段工艺25221材料与方法252211酶催化剂252212静息细胞制备252213主要试剂252214腈水解酶活力测定252215HPLC分析方法262216薄层色谱层析TLC26222PH对腈水解酶活性的影响26223温度对酶活性的影响27224不同底物浓度对腈水解酶活性的影响29225金属离子对转化反应的影响30226助溶剂对催化反应的影响32227分批补料催化生产RMA33228小结3423分离纯化工段工艺35第三章生物催化法生产RMA工艺放大研究3831产腈水解酶发酵罐放大工艺研究38323L催化体系与100ML体系反应结果比较4133小试工艺路线修正42331发酵液中催化反应的研究43332离子交换层析分离纯化RMA4334本章小节44第四章年产500TRMA的工艺设计4641概论46411设计任务46412设计的技术依据46413设计原则46414工艺流程4642发酵工段工艺47421操作流程48422灭菌操作48423操作要点4943物料衡算49431生产规模494311生产批量494312各阶段产量494313种子罐公称体积504314罐参数汇总50432发酵罐进出物料衡算504321发酵培养基原料计算504322发酵罐进出物料514323发酵罐设计524324发酵罐物料平衡图544325发酵罐示意图56433不对称水解工段物料平衡56434离子交换树脂HZ202计算57435制备RMA总物料衡算5744能耗分析58441蒸汽耗量分析584411发酵空消与实消584412干燥工段584413蒸发结晶精提取工段59442冷却水耗量分析594421发酵工段594422双效浓缩器浓缩工段5945经济效益分析60451年经营费用计算604511折旧费和大修费604512原材料、燃料消耗费用60452利润、利润率、投资回收期计算614521利润614522利润率614523投资回收期61453生产盈亏平衡点6146车间布置61461车间区域和工艺设备布置原则61462工艺过程工序划分62463车间区域布置及其环境设计等级确定6247“三废”处理62第五章结语64参考文献65附录一工艺流程图69附录二发酵罐示意图70附录三车间布置平面图71致谢73生物催化法生产R扁桃酸及其年产500吨规模的工厂工艺设计摘要R扁桃酸是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体，被广泛应用于制药与化工行业。生物催化法合成手性药物具有条件温和、催化效率高以及高度选择性等优点，并且无污染和能耗低，是一种环境友好型的绿色合成方法。腈水解酶作为生物催化法制备R扁桃酸的一种重要工业酶，得到了广泛关注。本文以腈水解酶产生菌重组ECOLIQ196S为研究对象，优化了重组腈水解酶的制备工艺，开发了PH连续调控工艺和甘油补加工艺，并在30L发酵罐中经放大验证，产酶水平可提高至24991U/L。研究了静息细胞不对称水解扁桃腈的转化条件，以及分批补料操作生产高浓度的R扁桃酸，确定了最优催化工艺条件菌体浓度50G/L，加入1MM的BA2和1V/V异辛醇作为助溶剂，最适底物浓度64MM，PH75，反应温度45C。经过95H的转化时间后，R扁桃酸的积累浓度可达到587MM，EE值99。本文还进一步研究了反应混合液中R扁桃酸的分离纯化工艺，在不影响EE值的前提下得到了高纯度的R扁桃酸。在小试研究基础上，本文经过中试工艺优化及修正，确定了工艺放大法则采用体积溶氧系数KLA常数，以及在分离纯化工段使用离子交换层析代替萃取操作。通过工艺流程设计、物料衡算、能量衡算、车间布置设计、“三废处理”及综合利用等内容的设计，完成了年产500吨纯度99的R扁桃酸工厂工艺设计。关键词生物催化，腈水解酶，R扁桃酸，工艺设计BIOCATALYTICSYNTHESISOFRMANDELICACIDANDPROCESSDESIGNOF500T/ASCALEABSTRACTRMANDELICACIDISTHEIMPORTANTFINECHEMICALINTERMEDIATESANDCHIRALPRODRUGWITHBROADUSESINPHARMACEUTICALANDCHEMICALINDUSTRYSYNTHETIZINGCHIRALDRUGWITHBIOLOGICALCATALYSISMETHODHASMANYADVANTAGES,SUCHASMILDCONDITIONS,HIGHEFFICIENCYANDHIGHSTEREOSELECTIVITY,ETCINADDITION,ITISNONPOLLUTIONANDLOWENERGYCONSUMPTION,WHICHISANENVIRONMENTFRIENDLYGREENSYNTHESISMETHODASNITRILASESAREIMPORTANTINDUSTRIALENZYMESTHATCONVERTMANDELONITRILEDIRECTLYINTOTHERMANDELICACID,THEYRECEIVEEXTENSIVEATTENTIONTHISDISSERTATIONISDEVOTEDTOTHECOMPREHENSIVEUNDERSTANDINGOFTHEFERMENTATIONFUNDAMENTALOFNITRILASEINTHERECOMBINANTECOLIQ196S,OPTIMIZINGTHEPREPARATIONTECHNICSOFRECOMBINANTNITRILASEANDDEVELOPINGANOVELTECHNOLOGYOFCONTINUOUSREGULATINGPHANDGLYCEROLFEDBATCHFERMENTATIONSUBSEGUENTLY,THEOPTIMUMPROCESSWASVERIFIEDIN30LFERMENTER,ANDTHEPRODUCTIONOFNITRILASEWAS24991U/LTHEPAPERINVESTIGATEDTHEBIOCONVERSIONCONDITIONSOFMANDELONITRILETORMANDELICACIDWITHRESTINGCELLSANDPREPARATIONOFRMANDELICACIDATHIGHACCUMULATIVECONCENTRATIONWITHFEDBATCHTHEOPTIMALCATALYSISCONDITIONSAREASFOLLOWS50G/LRESTINGCELLS,1MMBA2,1V/VISOOCTANOLASCOSOLVENT,SUBSTRATE64MM,PH75AND45CAFTERCONTINUOUSREACTIONFOR95H，ACQUIRED587MMRMANDELICACIDANDTHEEEVALUEWAS99AFTERWARDS,THESEPARATIONANDPURIFICATIONOFRMANDELICACIDFROMTHEREACTIONMIXTUREWERESTUDIEDBASEDONLABEXPERIMENT,THEPROCESSCONDITIONSWEREINVESTIGATEDBYMAGNIFIEDTESTANDDESIGNOFINDUSTRIALPRODUCTIONAFTERTHEPROCESSREVISED,KLAWASTHESCALEUPPRINCIPLEANDEXTRACTIONWASREPLACEDBYIONEXCHANGECHROMATOGRAPHYTOOBTAINPROCESSWORKSHOPOF500TONSRMANDELICACIDPERYEAR,SEVERALCONTENTS,SUCHASPROCESSDESIGN,MATERIALCALCULATION,ENERGYCALCULATION,WORKSHOPLAYOUTDESIGN,“THREEWASTES”TREATMENTANDCOMPREHENSIVEUTILIZATIONWERESYSTEMATICALLYINVESTIGATEDANDDESIGNEDKEYWORDSBIOCATALYSIS,NITRILASE,RMANDELICACID,PROCESSDESIGN第一章文献综述11简介单一构型手性药物已成为当前国内外新药开发和研究的关注重点，手性技术在新药研制中逐渐开始受到重视。手性药物在国内外上市销售的药物总数中所占比例正逐年上升，2005年全球范围内上市的新药已经有60是单一构型药物1。据报道，手性药物2000年销售增长率超过13，达到1330亿美元，2008年销售额已达2000亿美元2。自从欧洲爆发的“反应停”惨剧后，人们开始逐渐意识到消旋药物中的两个对映异构体在人体中的药理毒性、代谢过程以及药理活性都存在着极大的差异3。所以，美国食品及药物管理局FDA规定，使用消旋体申报的新药，需要提供关于消旋体和各对映异构体分别实施的毒理和药理实验报告，否则会被鉴定为药物中含有50的杂质而不予批准，还规定包含手性分子药物必须以单一对映异构体形式申报。由于存在着巨大的利润还有市场需求，全球各大制药企业纷纷将工作重点投入到手性药物的研究开发，掀起了一阵手性药物开发的热潮。扁桃酸MANDELICACID，MA又称作苦杏仁酸、苯乙醇酸或羟基苯乙酸，两种对映异构体结构如图11。光学纯R扁桃酸RMA是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体4，广泛应用于多种光学活性药物的合成，如头孢菌素和半合成青霉素等抗生素5,6、抗肿瘤药物7,8、减肥药物9、农药10及其他药物11,12。以R邻氯扁桃酸为中间体的抗血小板聚集药物氯吡格雷居全球最畅销药品排行榜第二位13，对氯扁桃酸是新型卵菌纲病害杀菌剂双炔酰菌胺的原料物质14。RMA还是重要的手性拆分剂和手性催化剂，而且还能用于测定手性物质的绝对构型及光学纯度等等。RMA被称为“万能”拆分剂15，其对醇胺类药物的拆分效果优秀16，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物，并且以RMA为催化剂可将芳香族及脂肪族醛均不对称转化成为相应手性醇17,18。HOHOHOR乙乙乙OHOHOHS乙乙乙图11S扁桃酸和R扁桃酸结构式科学家们正在不断开发RMA的新用途，RMA的市场需求与此同时也在日益扩大。据统计，国际上已有部分公司有能力合成光学纯MA19，主要公司有日东化学公司、日本山川药品公司以及德国瓦克公司等，但仍然不能满足市场需求。目前，国内也已经有部分企业能够生产光学纯的扁桃酸，但还没有出现规模化生产单一构型的报道。因此，加大力度对单一构型扁桃酸的研究开发，打破国外企业对手性RMA的市场垄断，并寻找出适合我国的工业化生产方法意义重大。与此同时，研究出新的生产工艺用于RMA和其他手性药物的工业生产，不仅对满足我国光学活性药物产品市场的需要具有实际意义，而且对解决手性技术领域所存在的多种问题也具有重大的理论指导意义。12RMA的工业合成方法最早产生也是国内目前仍在采用的RMA合成方法是先合成外消旋的MA，然后通过不对称拆分方法得到光学活性的RMA。外消旋MA的主要合成路线有三种20，分别是1以苯甲醛为原料CHOCHSO3NAOHNAHSO3CHSO3NAOHNACNCHOHCNNA2SO3CHCNOHH2OHCLCHCOHOHNH4CL2以苯为原料COHCOOHCHOHCOH3以苯乙酮为原料COCH3HCH3COH,CL2COCHCL2COCHCL23NAOHCHOHCONACHOHCONAHCLCHOHCOH其中，以苯法合成外消旋MA水污染严重，三废量大，而且成本较高；以苯甲醛为原料合成MA使用剧毒物氰化钠，而且工艺路线长，投资费用高；以苯乙酮为原料合成MA三废排放量小，工艺路线短，投资省，生产容易控制，其工艺流程图如图12。活性炭成品苯乙酮氯化水解酸化回收醚蒸馏萃取醚脱色苯热过滤冷却结晶过滤干燥回收苯滤饼废渣母液盐酸NAOH碎冰CL2活性炭成品苯乙酮氯化水解酸化回收醚蒸馏萃取醚脱色苯热过滤冷却结晶过滤干燥回收苯滤饼废渣母液盐酸碎冰苯乙酮氯化水解酸化回收醚蒸馏萃取醚脱色苯热过滤冷却结晶过滤干燥回收苯滤饼废渣母液盐酸碎冰图12以苯乙酮为原料合成MA的工艺流程图21外消旋MA的主要拆分方法有非对映体盐结晶拆分法、色谱拆分法、萃取拆分法、电泳拆分法和酶催化拆分法。目前工业上应用最广泛的拆分技术还是非对映体盐结晶拆分法。使用盐结晶法拆分消旋MA的拆分剂主要包括生物碱辛可宁、吗啡、麻黄碱、士的宁、手性胺L苯乙胺、2氨基1丁醇等、氨基酸及其衍生物等。其中生物碱和2氨基1丁醇拆分效果较好，RMA收率可以达到758522,23。在20世纪70年代时，美国CYANAMID公司就开始使用2胺基1丁醇对消旋MA进行拆分，并且对副产物进行了消旋，效果良好24。另外，美国KAYFRIES公司开发了D苯甘氨酸丁酯及其盐酸盐作为拆分试剂，对消旋MA进行拆分的技术，但是只得到了一种MA的对映异构体25。在此基础上，臧健等人同样使用D苯甘氨酸丁酯及其盐酸盐作为拆分剂，在水反应体系中制得RMA收率989，光学纯度32；SMA收率901，光学纯度66726,27。L丙氨酸和L苯乙胺是当前工业生产手性MA的主要拆分剂，采用L丙氨酸拆分一次，重结晶两次可获得RMA收率98以上28；以L苯乙胺为拆分剂，重结晶两次后RMA总收率296，光学纯度995。后来，EELOC等人通过比较二元相图，发现S甲基苯乙胺更加适合作为MA的拆分剂29。色谱拆分法也是较常用的MA手性拆分方法，所使用的色谱体系以HPLC为主。环糊精CD是色谱法所使用的主要手性拆分剂，后来经过各种修饰CD作为固定相的拆分效果有了较大改进。阮源萍等人采用自制的2,6二O戊基环糊精涂渍SYMMETRYC8色谱柱，以反相HPLC模式研究了消旋MA的色谱拆分，分离条件也得到了优化30。研究结果表明，采用优化后的05三乙胺甲醇乙酸缓冲液或者水甲醇流动相，MA的对映异构体能够达到甚至接近基线分离。色谱拆分法的拆分纯度最高，具有良好的稳定性、选择性以及容量，但是这种方法消耗和设备费用都太大，成本高，不适合工业规模化生产。近几年，KASPEREIT等人提出了模拟流动床色谱SMB概念，节约了投资和操作成本31。SMB打破单一色谱柱分批处理方式，形成连续处理，极大程度地提高了生产力。MALTE等人进一步采用SMB和选择性结晶相混合的方法，对消旋MA进行拆分，放弃了原本仅有一个操作单元的拆分体系，形成了更多的单元，从而达到降低成本，提高效率的目的32。手性萃取拆分法是近几年才提出的手性分离方法，具有相当大的潜力，该方法的基本原理是依靠两种对映异构体与手性选择体生成两种非对映异构体的自由能差，从而将外消旋体分离，若是在足够多的级数下，可实现对映异构体的高纯度分离。唐课文等人研究了以疏水性L酒石酸酯作为手性选择体，RMA和SMA在水有机溶剂两相体系，以及以NN十二烷基L羟基脯氨酸作为手性选择体，在含有NN十二烷基L羟基脯氨酸手性配体LI和CU2两相体系中的分配行为33,34。色谱拆分法虽然潜力很大，但是因为是新方法，所以技术上并不成熟，有待进一步完善与发展。毛细管电泳CE是一种电迁移技术，由于具有经济、快速、高效等特点，广泛应用于各种药物对映体的分离。扁桃酸的毛细管电泳拆分,主要有亲和毛细管电泳AZE、毛细管电色谱CEC和毛细管区带电泳CZE3种。CE的原理是加入手性选择剂与对映体分别结合，根据选择剂和对映体结合的稳定常数差异进行分离。邱彬等人以羟丙基CD作为手性选择体，TRISH3PO4为缓冲溶液，用CE法拆分消旋MA，得到RMA平均回收率978，分离度159；SMA平均回收率1015，分离度为16835。毛细管电色谱CEC是HPLC和CE相结合的新型液相色谱分离技术，它继承了HPLC的高选择性和毛细管电泳的高效率，同时还能有效分离毛细管电泳法不能分离的某些物质。能够应用于CEC法的手性选择剂有很多，其中最好的一种是糖肽类抗生素GAS。SALVATORE等人把大环抗生素MDL63,246HEPTATYR作为手性固定相，采用反相HPLC的CEC法成功对消旋MA进行了拆分36。酶催化拆分法属于动力学拆分方法，该方法的原理是利用酶对特定光学异构体的专一性，催化某一对映异构体优先反应，再利用物理化学性质差异实现对映异构体的分离。GANAPATI等人在非水介质中，以脂肪酶为催化剂，对MA的对映体进行手性分离，认为CANDIDA的脂肪酶NOVOZYM435作为催化剂具有良好的效果，RMA的光学纯度78，转化率1937。近几年，许多新技术被用于改进酶催化拆分方法。微生物表面展示技术应用于外消旋有机酸的拆分，将PSEUDOMONASFLUORESCENS脂肪酶展示于ESCHERICHIACOLI细胞表面，制作的整细胞生物催化剂，在拆分消旋MA时具有更好的活性和选择性，并在120H重复10次实验均能保持活性38。通过可控制的固定相和介质工程技术，可以调整脂肪酶的对映异构体选择性39。EIJI等人混合了PSEUDOMONAS降解SMA制备RMA体系，以及用MICROCOCCUSPROPIONIBACTERIUMFREUDENREICHII催化苯甲酰甲酸不对称转化为RMA体系，优化了拆分过程，RMA的最终收率达到60，化学纯度900、光学纯度99040。酶催化拆分法立体选择性强，反应条件温和，污染少，但是如何提取出活性单一的对映异构体，选育高效、专一的微生物菌种，提高酶自身稳定性，都是目前亟待解决的问题。宋航等41人发明了一种RMA工业化连续制备方法。采用光学纯的D苯甘氨酸正丁酯拆分剂与外消旋MA反应生成两种非对映异构体的盐，然后利用两对非对映异构体盐在拆分剂和重结晶溶剂中的溶解度差异将它们分离，再通过重结晶操作将非对映体盐提纯，通过酸化、萃取、蒸发得到RMA，将拆分后的过滤液蒸干用水溶解，酸化、萃取、蒸发得到SMA；再将重结晶液浓缩，加入一定量的外消旋MA于浓缩液中进行拆分，水相中的拆分剂通过加入碱液回收，实现了拆分剂的回收利用。再将光学纯度在6070的SMA通过L苯甘氨酸正丁酯进行拆分，并依照类似方法实现SMA的拆分和拆分剂的回收利用，最终获得的RMA和SMA光学纯度均在99以上。13生物催化法合成RMA由于生物酶对底物有高度的立体选择性，不仅包括化学选择性和非对映异构体选择性，还具有严格的区域选择性和对映异构体选择性，可直接将化学合成的外消旋衍生物、潜手性化合物或前体转化成单一对映异构体的光学活性产物。生物催化的手性反应还具有效率高、反应条件温和、反应步骤少、产品光学纯度高等优点，并且生物催化过程能耗低、无毒、无污染，符合21世纪“绿色化学”的要求，被认为是手性药物生产取得突破的关键技术。总结国内外文献报道，主要通过3种酶催化反应合成RMA利用脂肪酶分解扁桃酸甲乙酯制备RMA；利用氧化还原酶体系催化制备RMA；依赖于腈水解酶，以外消旋的扁桃腈为底物，制备光学纯RMA。131脂肪酶法生物催化合成RMA脂肪酶法以消旋扁桃酸甲乙酯为底物，利用脂肪酶优先反应生成RMA这一特点，以控制在反应初期生产具有较高对映过量值EE值的RMA，反应过程如图13。CHHOCOOCH2CH3H2OLIPASECHHOCOOHCHHOCOOHCH3CH2OHR,S乙乙乙乙乙R乙乙乙S乙乙乙图13扁桃酸乙酯转化生成RMA42YADAV等对脂肪酶在非水相介质中催化水解外消旋扁桃酸甲酯制备RMA进行了研究。用离子交换树脂IRA400作为催化剂通过酯化作用将外消旋的MA与甲醇混合制备外消旋扁桃酸甲酯，再分离得到RMA。用NOVOZYM435脂肪酶特异性水解24H后，光学纯度达78，转化率1937。高静等在非水体系中对脂肪酶催化水解扁桃酸乙酯外消旋混合物拆分RMA进行了初步研究。筛选出脂肪酶N435作为催化剂，叔丁醇作为溶剂，R扁桃酸乙酯的转化率416，EE值8443。随后王垚等对脂肪酶在离子液体中不对称水解扁桃酸乙酯制备RMA进行了研究，发现脂肪酶NOVOZYM435在离子液体BMMBR中的活性和立体选择性最高。与在叔丁醇介质中拆分相比，EE值有所降低但产率大幅上升，并且反应时间缩短了1/4，由于离子液体的循环使用，这种方法更加符合可持续发展的战略目标44。在最适条件下反应6H，产物RMA的EE值可达5878，产率6523。脂肪酶在对外消旋底物进行对映体选择性水解的时候，未参加反应的对映体往往会保留，必须对其进行消旋化作用，这样才能从根本上提高单一异构体的EE值。132氧化还原酶催化合成RMA苯乙酮酸已成为一种廉价、广泛使用的化工原料，对其直接进行不对称还原，制备高光学纯度的RMA，将减少一步酶促反应45。李忠琴等以苯乙酮酸为底物，筛选出的酵母菌突变株SC1MA16为催化剂，合成的RMA收率达99，EE值99846。黄亚燕等考察了酵母菌株FD11B，不对称还原苯乙酮酸，生产RMA的重复使用性能。在持续6批次的还原反应中，一直保持着较高的催化活性，并且EE值均高于965。最优条件下30L发酵罐，进行分批放大实验，反应时间49H，产物RMA收率达961，EE值98547。随着游离细胞转化苯乙酮酸制备RMA的深入研究，也由于固定化细胞有利于操作，储藏稳定性好等优越性，研究者开始使用固定化酵母细胞，为了增加菌体的稳定性和利用率。LI等研究了壳聚糖包埋啤酒酵母将苯乙酮酸生物不对称还原为RMA，并研究了固定化条件及特性48。XIAO等研究了使用海藻酸钠固定化SACCHAROMYCESCEREVISIAEFD11B，生物转化苯乙酮酸制备RMA的动力学特征，建立了有关还原动力学和内扩散的数学模型，分析胞内传递传质的影响49。建立动力学模型能更好的分析固定化细胞转化，并对其提供理论依据。133腈水解酶催化合成RMA腈水解酶是一类可以将腈转化成相应酸的酶，当以扁桃腈为底物时，腈水解酶不对称水解成RMA，并且它的理论动力学反应产物收率是100，本设计采用的就是腈水解酶法生物催化合成RMA。国内许建和团队以乙腈为唯一氮源，从土壤中筛选获得了一株腈水解酶菌株，并命名为ECU0401。研究发现ECU0401所产生的腈水解酶能有效地催化消旋扁桃腈不对称水解为RMA，其最适PH65，反应温度30C，经过12H的催化反应，RMA的收率为415，EE值超过99950。PATHAK等还发现大麦、卷心菜、萝卜等多种植物中富含腈水解酶，这大大扩展了腈水解酶的来源。提高腈水解酶稳定性，并对其进行回收利用，可以极大地降低生产成本。KAUL等发现海藻酸盐固定化细胞效果最好，静息细胞只能重复利用9次，而海藻酸盐固定化后的细胞可反复利用35次，仍具有88的转化活性，EE值保持9751。近年来快速发展起来的遗传学和基因工程也为进一步高效利用腈水解酶提供了可行性条件和理论基础。DESANTIS等建立了一个腈水解酶库，首先从腈水解酶库中筛选得到有效水解扁桃腈合成RMA的对象，然后对其中产量较高的腈水解酶进行深入研究，催化反应3H后产率86，EE值98。REY等则对由ALCALIGENESFAECALISATCC8750中提取到的腈水解酶进行基因修饰和固定化发现，该固定化腈水解酶能高效选择性水解消旋扁桃腈生成RMA，PH85时收率和EE值均可高达9952。因此，结合固定化和基因重组技术制备RMA应用前景广阔。BANERJEE等将PPUTIDA中的腈水解酶基因克隆至PET21B，并作为组氨酸标记蛋白在ECOLI中过量表达。通过IPTG诱导ECOLIBL21细胞，从粗细胞提取物中纯化得到组氨酸标记蛋白。具有高腈水解酶活性的重组ECOLI被用于不对称水解外消旋扁桃腈合成RMA。由于催化反应过程中扁桃腈会自发降解为HCN和苯甲醛，伴随着RMA和NH3的生成，反应液中的扁桃腈浓度不断降低。反应结束后，单位体积产量单位体积反应液每小时生成的RMA质量为114G/L/H，催化产量每克催化剂生成RMA的质量为136G/G，与原始菌株相比均有较大提高。本实验室从土壤中筛选出了一株产腈水解酶菌种，经过诱变育种技术，得到遗传稳定的高活性菌株ALCALIGENESFAECALISZJUTB10，成功开发了腈水解酶生物催化制备RMA的工艺，并已在企业完成了生产中试阶段。目前，腈水解酶作为生物催化剂不对称水解扁桃腈制备RMA的工艺过程如图14。菌体发酵制备腈水解酶细胞固定化固定化细胞扁桃腈水解静息细胞扁桃腈水催化剂分离脱色浓缩RMA产品菌体发酵制备腈水解酶细胞固定化固定化细胞扁桃腈水解静息细胞扁桃腈水催化剂分离脱色浓缩产品图14腈水解酶催化生产RMA工艺过程14腈水解酶研究概况腈水解酶最早是由THMAN和MAHADEVAN于1964年从大麦叶中分离出来，能够将吲哚乙腈水解成为吲哚乙酸，所以将该酶命名为吲哚乙腈水解酶。但是在往后的研究中发现，这种纯酶对26种不同的腈化合物均具有活性，它的最适水解底物不是吲哚乙腈，而是3氰基吡啶，水解3氰基吡啶的酶活是吲哚乙腈的8倍。因此，THMAN和MAHADEVAN将其命名为腈水解酶NITRILASE,EC3551。近年来有学者在拟南芥ATHALIANA中分离出四种腈水解酶，包括有NIT1、NIT2、NIT3、NIT4。前三种腈水解酶能将3吲哚乙腈转化成3吲哚乙酸，而NIT4只对氰基L丙氨酸有催化能力53。根据底物特异性，腈水解酶普遍被分成三大类1芳香类腈水解酶，主要水解芳香腈，如某些真菌酶和RHODOCOCCUSRHODOCHROUSJ1；2脂肪类腈水解酶，主要水解脂肪族的氰基，如ACIDOVORAXFAECALIS72W和RRHODOHROUSK22菌株产生的腈水解酶；3芳基乙腈水解酶，主要水解芳基乙腈类物质。表11显示的是来自于不同微生物的腈水解酶性质比较。表11不同微生物腈水解酶比较SOURCEMOLECULARMASSKDAOPTIMALPHOPTIMALTEMPERATURECREFERENCEALCALIGENESFAECALISATCC875046075404554ALCALIGENESFAECALISJM3275754555ASPERGILLUSNIGERK10650804556ALCALIGENESSPECU040137680404557BRADYRHIZOBIUMJAPONICUMUSDA11034070804558FUSARIUMSOLANIO158080404559PSEUDOMONASUORESCENSPF5138704560PSEUDOMONASPUTIDA412704051根据氨基酸的同源性，腈水解酶属于蛋白超家族，同时也称为腈水解酶超家族。腈水解酶超家族中的酶都含有一个特定的空间结构，蛋白结构单元由一个的三明治结构组成53。腈水解酶的这种结构已经通过XRAY衍射技术得到确认，并且其空间结构也通过与超家族内其他成员的同源性比较而推导出61。腈水解酶的反应机理如图15所示，腈水解酶的半胱氨酸残基上的巯基具有很强的亲核性，使整个过程类似于一般化学反应中碱催化下的氰基水解62。腈水解酶的活性部位不含有金属离子，绝大多数金属离子及金属离子螯合剂，比如EDTA、重氮基和氰基等对酶活力都没有明显抑制作用，但是能与巯基反应的金属离子，如AG和HG等却对腈水解酶有较强的抑制作用。由此可知，腈水解酶半胱氨酸上的巯基在催化水解反应过程中起着关键性作用。BRENNER等将腈水解酶超家族分为13个分支，并发现在果蝇及蠕虫中的组氨酸三联体FHIT，和腈水解酶NIT形成融合蛋白共同编码63。实验检测8只小鼠，其中有7只的NIT和FHITMRNA积聚水平相同，由此推测FHIT的接头分子可能是NIT。根据蠕虫NITFHIT晶体结构分析，其活性部位含有GLULYSCYS残基，BRENNER等人推测整个腈水解酶大家族的催化活力是由GLULYSCYS催化单元主导，GLULYSCYS三联体残基的结构如图1662,64。腈水解酶反应的高效性还有温和性，使得其具有重要的工业应用价值，而且在工业生产上应用成功的例子已有较多报道。例如，LONZA公司筛选出新的菌株用于5羟基吡嗪2甲酸及5羟基吡啶2甲酸的生产，利用烟酸羟基化酶和腈水解酶的协同作用，转化率接近100，明显优于传统化学法。杜邦公司利用ACIDOVORAXFACILIS72W腈水解酶，开发了催化2甲基戊二腈制备1,5二甲基2哌啶酮的工业化生产过程。RCNENZSHRCNHSENZH2ONH4RCOSENZRCOOHH2OSENZ图15腈水解酶催化反应机理62图16腈水解酶超家族三联体结构6215生物制药过程放大研究进展151生物制药工艺设计生物药物是世界各国医药产业重点发展的方向，生物制药在制药行业中占据着重要地位。生物制药工厂工艺设计是生物制药企业基本建设的关键一步，必将发挥越来越重要的作用。生物制药工厂工艺设计，不仅要具有一般制药工厂工艺设计知识，如生产工艺流程设计、工艺设备布置设计、管道设计以及制药过程原料和设备、药物制剂生产工艺、药品生产质量管理规范、化学工程、药物分离与纯化技术等，而且还要具有生物制药工厂工艺设计的专门知识65。生物制药工厂工艺设计是一门综合应用型学科，在具体进行生物制药工厂工艺设计时必须遵循相关国家规范、规定和标准，做到技术上先进，经济上合理。生物制药工厂工艺设计的要求有1随着科学技术的发展，生物制药工厂已逐步实现现代化生产，在产品结构、工艺技术、生产装置、基础理论研究等方面都有较大突破。因此，在进行生物制药工厂工艺设计时，应反映科学技术的进步，采用先进的工艺技术和装置。2设计工作必须认真进行调查研究，加强技术经济的分析工作，设计的技术经济指标以达到或超过国内同类型工厂生产实际平均先进水平为宜。3生物制药工厂工艺设计是系统工程，涉及相关的规范、规定等，在应用时，要给予正确的体现。尤其是要遵循可持续发展的原则，严格执行药品生产质量管理规范和标准工艺操作规程来指导设计。4生物制药工厂工艺设计要求设计人员应具备一定的工程实践经验和理论知识，要经常深入生产现场，不断总结提高，绝不能拿设计做实验，不成熟的技术不能用于设计，以免给建设单位或业主带来重大经济损失。5生物制药工厂厂房应尽量做到造型简单、简洁，兼顾美观大方。生物制药工厂厂房应首先做到满足生产工艺，否则会给工艺设计等专业带来极大的困难或不合理。152生物工程优化与放大随着生命科学研究的深入发展，对细胞内过程机理的认识越来越清晰，但是基于单一生理调控机制出发的研究往往只揭示了生理调控的局部和某一时段的特点，仅靠高度分支化和具体分散的研究难以对整个生物反应器生物过程全局优化起决定性作用。因此，如何在这些过程信息中寻找对过程全局优化有效的信息就成为重要问题。张嗣良等66提出了生物反应器生物过程多尺度问题，试图采用工程学方法解决以上复杂系统的优化问题。把生物反应器中复杂的生物过程，分解为不同尺度的特性进行研究，用以了解不同尺度事件之间的关系。每个尺度都有不同的学科原理和变化规律，研究它们之间的量变到质变，以及由此形成的对复杂系统总体的影响，采用发酵过程参数相关性的原料与方法，进而在包含多种因素的庞大数据中，寻找出影响发酵过程全局优化的敏感生理参数。这样才有可能解决发酵过程优化所面临的局部与整体的关系，由此实现全域性的跨尺度测量与控制，达到生物过程全局优化的目的。生物过程多尺度分析方法如图17。HEATAGITATEAERATIONPRECURSORCARBONNITROGENACIDGENESCALECELLSCALECELLREACTORSCALEBIOREACTORSIGNALCONDUCTIONKINETICVARIABLESENVIRONMENTVARIABLESINNERFEEDBACKMETABOLICFLUX图17生物反应器过程多尺度分析66处于生物反应器中生长的微生物细胞，作为我们研究生物过程放大时的考察对象，微生物细胞受到生物反应器中各种因素的影响，基因型所表现出来的综合表型即为其生理状态。因此，研究生物过程放大时必须考虑到时刻变化的菌体代谢和生理特性，与生物反应器体系间的相互影响。不论是从工程角度的混合、传递传质，还是从发酵环境等出发，反应器中生长的细胞才是最终作用对象，然而细胞的生长代谢与其局部环境密切相关。储炬等指出在生物过程放大途中，反应器流场特性会时刻改变，而这种变化又会进一步对细胞的生理代谢产生影响。因此，研究生物过程放大时，我们应该将反应器流场特性变化与伴随其改变的细胞生长代谢特性结合考虑。在分析反应器流场特性变化对细胞生理代谢的影响时，可以借用“规模缩小”方法研究这些影响因素。图18表示的是生物过程优化与放大方案示意图。电泳光谱色谱在线/原位测量ELECTRICTONGUESARTIFICIALNOSES芯片实验室技术生理参数物理参数影响分析综合流体力学过程描述模型开发工艺流程优化按比例放大参数验证按比例放大规模缩小计算流体力学化学计量学模型神经网络电泳光谱色谱在线原位测量芯片实验室技术生理参数物理参数影响分析综合流体力学过程描述模型开发工艺流程优化按比例放大参数验证按比例放大规模缩小计算流体力学化学计量学模型神经网络生理参数物理参数影响分析综合流体力学过程描述模型开发工艺流程优化按比例放大参数验证按比例放大规模缩小计算流体力学化学计量学模型神经网络图18生物过程优化与放大方案67153生物反应器设计生物反应器的作用是为细胞代谢提供一个适宜的物理及化学环境，使细胞能更快更好地生长，并得到更多需要的生物量或代谢产物。一个优良的生物反应器应具备严密的结构；良好的液体混合性能；较高的传质、传热性能；配套而又可靠的检测和控制仪表。判断生物反应器好坏的唯一标准是该装置能否适合工艺要求以取得最大的生产效率。与化学反应器不同，生物反应器设计应遵循的原则有1在培养系统的已灭菌部分与未灭菌部分之间不能直接连通。2尽量减少法兰连接，因设备震动和热膨胀会引起法兰连接处移位，导致污染。3防止死角、裂缝等情况。4某些部分可以单独灭菌。5易于维修。6反应器可保持小的正压。生物反应器设计的主要目标是使产品的质量高、成本低。生物反应器处于生物过程的中心，是影响整个生物过程的经济效益的一个重要方面，反应器开发的趋势和未来的方向是多样化、大型化和高度自动化。16本论文的研究目的与内容由于市场对RMA的需求与日俱增，并且腈水解酶介导的生物催化法生产RMA具有巨大的工业化应用前景，本文研究目的在于提高腈水解酶产酶水平，寻找高效、高产量催化制备RMA的最优工艺，并研究出生产RMA的最佳设计方案。本论文以本实验室自我筛选并重新构建得到的重组工程菌ECOLIQ196S为研究对象，主要研究内容包括四部分1优化了腈水解酶的制备工艺，开发了甘油补加工艺，并对优化后的工艺进行了放大研究。2以静息细胞作为催化剂，优化了扁桃腈不对称水解工艺。3研究了反应混合液中产品RMA的分离纯化工艺，并对工艺进行了优化修正以适合工业化生产。4在以上研究基础上，进行了年产500吨RMA的制备工艺设计。第二章生物催化法生产RMA小试试验工艺研究R扁桃酸的生产技术主要有光学异构体拆分法和不对称化学合成法。由于不对称化学合成法所得产物的EE偏低6585，无法用于手性药物的合成，并且所采用的催化剂价格昂贵、回收不便，导致成本过高，难以工业化生产。目前，工业上合成R扁桃酸的主导方法是化学拆分法，先合成外消旋的扁桃酸，然后采用非对映体盐结晶拆分法得到具有光学活性的扁桃酸，其理论收率仅有50，且所用的试剂具有一定的毒性，在一定程度上造成了资源的浪费和环境的污染。生物催化法手性合成RMA具有条件温和、效率高、能耗低，高度的化学选择性、区域选择性以及对映体选择性等优点，是一种环境友好型的合成方法，近几年生物催化法合成RMA得到了广泛关注。特别是以腈水解酶作为生物催化剂，不对称水解外消旋扁桃腈的方法，具有良好的工业开发和应用前景，已经成为各国争相开发的酶催化技术。本文采用腈水解酶法生产RMA，其反应机制如图2168。由图21可知，S扁桃腈在水溶液中可以通过自发水解生成苯乙醛和氢氰酸，再进一步生成R,S扁桃腈，最终使得RMA的理论收率可以达到100，原料得到充分利用。目前已报道的能产腈水解酶的菌株主要有ALCALIGENESFACCALISATCC875054、PPUTIDAMTCC511051、ALCALIGENESSPECU040157等。然而商业化的腈水解酶十分有限，极大地限制了它的应用，本实验室利用PCR方法扩增出ECOLIJM109腈水解酶基因，并对其进行定点突变然后插入到表达载体PET28B中，经IPTG诱导后，腈水解酶在大肠杆菌胞内进行了活性表达，得到重组菌株ECOLIQ196S。图21腈水解酶不对称水解R,S扁桃腈反应机制生物催化法生产RMA整个工艺总体上分为三个工序，即发酵产酶、不对称水解和产品的分离纯化。21发酵产酶工段工艺重组腈水解酶具有出色的表达特性，重组ECOLIQ196S发酵条件的优化对于重组腈水解酶的合成起着十分重要的作用。此前，本实验室已对产重组腈水解酶的重组ECOLI发酵过程优化进行了大量研究，并且有多篇文献报道。本章中，为了提高腈水解酶的产量及酶活，用于不对称水解扁桃腈合成高纯度的RMA，对发酵温度及时间、诱导剂种类及诱导策略、小试PH调控工艺及补料策略等进行了研究。211材料和方法2111菌株原始菌株AFAECALISZJUTB10由本实验室筛选得到，保藏于中国典型培养物保藏中心（中国，武汉，武汉大学），保藏编号CCTCCM208168。实验所采用的菌株是由本实验室通过基因重组技术将原始菌株重新构建得到的重组ESCHERICHIACOLI，编号为Q196S。2112培养基斜面培养基（G/L）胰蛋白胨100，酵母粉50，NACL100，琼脂150，卡那霉素50MG/L。种子培养基（G/L）胰蛋白胨100，酵母粉50，NACL100，卡那霉素50MG/L。发酵培养基（PH75）磷酸盐蛋白胨酵母粉NH42SO4NACL甘油KH2PO4K2PO43H2OMGSO47H2O15G/L12G/L5G/L10G/L10G/L136G/L228G/L0375G/L以上培养基均在121C灭菌20MIN。2113菌种培养条件菌种保存1将菌种转接至含有50MG/L卡那霉素的斜面培养基上，4C保存短期保存；2在甘油管中将新鲜培养的种子液与等体积30甘油混合，置于80C保存长期保存。种子培养从斜面培养基上挑取菌落，接入含有50ML种子培养基的250ML摇瓶中，37C，180RPM过夜培养。摇瓶发酵将种子液按5接种量转接至装有100ML发酵液的500ML摇瓶中培养。发酵罐产酶5L发酵罐（上海保兴生物设备有限公司），发酵液装液量3L，接种量5。搅拌转速500RPM，通气量和罐压分别为2VVM和004006MPA。2114生物量测定生物量的测定采用浊度法，取一定量的发酵液，用去离子水适当稀释，振荡摇匀，测定OD600的吸光值。菌体浓度根据测得的OD600和标准曲线（图22）计算。02468101214161800501015020250303504OD6BIOMASG/LY02305X0186R92图22菌体浓度标准曲线2115腈水解酶活力测定将培养好的发酵液在4C、9000G条件下离心10MIN，弃上清收集菌体，用生理盐水洗涤2次收集备用。准确称取菌体005G悬浮于10ML磷酸缓冲液（100MM，PH75）中，加入底物扁桃腈50MM，45C、180RPM条件下反应10MIN，立即取样500L，然后加入500L的4MOL/L盐酸终止反应，混合液在12,000RPM下离心10MIN取上清液，HPLC检测腈水解酶活力。HPLC使用的色谱柱为HYPERSILODSC18柱（5M,250NM46NM），流动相为甲醇NH4H2PO450MM6535V/V，柱温40C，检测波长228NM，流速1ML/MIN。1个酶活单位定义为每分钟催化生成1MOL产物扁桃酸所需的酶量，单位为U；比酶活表示每克菌体的腈水解酶活力，单位为U/G；体积酶活表示单位体积里的总酶活，单位为U/L。212诱导剂的选择乳糖操纵子控制合成重组腈水解酶，IPTG和乳糖都可以高效地诱导它的表达。这两种诱导剂对诱导合成腈水解酶的影响分别做了研究，实验结果如图23。从图23中可看出，乳糖的诱导效果明显高于IPTG，并且当乳糖浓度为5G/L时，发酵得到的生物量以及腈水解酶活力最高，分别达到159G/L和317U/G。随着乳糖浓度继续增加，腈水解酶活力没有明显提高，生物量反而下降。从工业应用角度考虑，乳糖作为诱导剂相对于IPTG也要廉价的多，因此，后续实验选择5G/L乳糖作为诱导剂。0010203042527028530315ACTIVTYBIOMASIPTGCONCETRAIONMMACTIVTYU/G1011213141516B01234567891012527028530315LACTOSECONCETRAIONG/LACTIVYU/G011213141516ACTIVTYBIOMASBIOMASG/LBIOMAS/LA图23不同诱导剂对产酶能力的影响。培养条件37C、180RPM培养4H后，加入诱导剂继续培养8H。AIPTG诱导效果，B乳糖诱导效果。213发酵温度优化温度是发酵过程中的重要因素之一，菌体生长过程中，温度的变化对生物量和产酶都会产生一定程度的影响。温度升高，细胞的生长和代谢速度加快，有利于菌体量的累积和产酶；而较高的温度，却会造成菌体内部的酶和其他活性物质失活，产生负面影响。因此，我们对发酵温度进行了优化。图24表示，37C适合菌体生长，但是不