重庆石灰岩地区先锋树种复羽叶栾树幼苗喜钙耐旱特征及适应机理研究

重庆石灰岩地区先锋树种复羽叶栾树幼苗喜钙耐旱特征及适应机理研究第一章文献综述岩溶主要指水对可溶性岩石如碳酸盐岩（石灰岩、白云岩等）、硫酸盐岩（石膏、硬石膏等）和卤化物岩（岩盐）等的溶蚀作用，及其所形成的地表及底下的各种景观与现象1。在岩溶发育过程中所发生的各种作用，都是以可溶性岩被水溶解的作用为基础的，所以岩溶作用最本质的现象就是“岩石的溶解”，即是以地下水为主，地表水为辅；以化学过程（溶解于沉淀）为主，机械过程（流水侵蚀和沉积，重力崩塌和堆积）为辅的对可溶性掩饰的破坏和改造作用。因此岩石的可溶性、透水性，水的溶蚀性、流动性是岩溶作用发生的基本条件1。11岩溶生态系统的定义生态学上把“生态系统定义为“在无机和有机之间，有生产者（植物）、消费者（动物）和分解者（微生物）构成的系统”。美国地质学会编的“GLOSSARYOFGEOLOGY”则把生态学定义为“研究生物与其环境之间关系的科学，包括对生物群落、生命形式、自然循环、生物之间相互关系、生物地理、种群变化的研究”，而将“生态系统”定义为“生态学的单元，包括环境与生命要素，以及在该单元之间并对该单元有制约作用的诸因子”2,3。岩溶生态系统有无机环境（富钙镁、偏碱性可溶岩、土壤贫瘠和双层的特殊水文系统）和有机方面（喜钙、旱生、石灰岩溶植被和地下生物群落）两部分组成，据此把“岩溶生态系统”定义为“受岩溶（地质）环境制约的生态系统”。其生命部分和无机环境相互作用46。其内涵既包括岩溶环境如何影响生命，也包括生命如何影响岩溶环境。12岩溶生态系统的生境特点121成土速率极慢岩溶地区土壤为碳酸盐岩风化而成。碳酸盐岩是指碳酸盐矿物含量超过50的沉积岩，酸不溶物低于50。我国大部分碳酸盐岩中酸不溶物含量较低，例如西南地区多数碳酸盐岩酸不溶物含量一般不超过10，甚至更低，并且主要是纯灰岩和纯白云岩。这些岩类主要由可溶性矿物组成，具有较高的腐蚀速率，但仅含有少量的酸不溶性物质，这些不溶物质经风化、溶蚀二残留下来，构成了岩溶地区土壤的主要成分。由于土壤来源物质少，再加上以石灰岩和白云岩为主的碳酸盐岩岩性坚硬，抗物理风化能力强，风化破碎十分缓慢。造成碳酸盐岩的成土速率极慢712。袁道先13研究表明贵州灰岩风化，每形成1CM厚的土层需要4000余年。柴宗新9的研究，形成1CM厚土层需10003200年。122土壤对表层岩溶水调蓄能力差土壤水文调蓄能力通常以土壤调蓄系数来表征，所谓土壤调蓄系数即一场降雨过程中最大土层水分增量与同时段降雨渗透补给量的比值，研究表明良好生态环境下的土壤调蓄系数大，对表层岩溶水调蓄能力强14。在西南岩溶区，岩溶石山分布广泛，虽地处亚热带，水热条件较好，降雨时空分布不均。由于土层浅薄、地表地下岩溶发育，并且广泛发育着地表和地下的双重空间结构地下洞隙纵横交织，地下河发达，形成作为岩溶标志的地下溶洞。地表水漏失严重，水土流失严重，地表面附近浅部岩石破碎，导致水土资源空间配置严重失调，形成“地表水贵如油，地下水滚滚流”的特殊水土资源格局，以致土壤贫瘠，水土流失严重，地表水资源匮乏1520。19世纪中叶以来，随着森林的破坏，石漠化加剧，环境调蓄表层水的功能减弱，水土流失速度加快，目前岩溶水循环及水资源状况发生了显著的变化，泉水衰减，水质恶化，大多数表层岩溶水只有在大暴雨期间才形成超渗产流，然后以表层岩溶泉水的形式流出地表。旱季，表层岩溶泉水普遍断流，使西南岩溶山区大量居民丧失了原有的饮用水供水条件，造成严重的干旱缺水问题21。123土壤的富钙性由于石灰岩地区土壤由可溶性岩石如碳酸盐岩等风化形成。其土壤具有偏碱性和富钙性6。研究表明，从石灰岩地区泉水的水化学检测看，白云岩表层泉水的PH偏高。CA2浓度偏低，但与砂页岩中的裂隙水（全年平均PH666，CA2浓度191MGL1）相比，石灰岩表层泉水（平均PH值713、CA2浓度6478MGL1）的PH值高出047，CA2浓度高出4577MGL1。白云岩表层泉水（平均PH755，CA2浓度6235MGL1）的PH高出089，CA2浓度高出4335MGL122。对桂林岩溶试验场石灰土的分析表明，石灰土中的钙主要以交换态形式为主，钙在石灰土中有很高的活度23。124石灰岩地区植物特点石灰岩特殊的生境特点对植物种类、成分有强烈的选择性喜钙性、耐旱性及石生性的植物种群；这类植物通常具有发达而强壮的根系；植物体的钙含量较高，“树包石”现象普遍存在24；限于严酷的环境条件，树木的生长具有速率慢、绝对生长量小，但生长稳定，波动较小，以及种间、个体间生长过程差异较大的特点25。13植物抗旱性研究进展目前，水资源短缺是公认的全球性环境问题之一。据统计，地球上有三分之一以上的土地面积属于干旱和半干旱的地区，在我国，干旱、半干旱土地面积占全国总面积的47，占耕地总面积的5126。干旱严重影响植物的生长，使作物严重减产、生态环境日益恶化，同时也加剧了全球性的粮食危机。在我国北方草原和沙漠地区、南方的干热河谷和岩溶地区，自然条件恶劣，生态环境脆弱，干旱化、沙漠化、石漠化加剧，已成为最大的环境问题。干旱胁迫是指由于干旱缺水所产生的植物内部正常生理功能的干扰，通常又称之为水分胁迫。植物的抗旱性，即植物在干旱环境中生长、繁殖或生存的能力，以及在水分胁迫解除后迅速恢复的能力。通常将植物对水分胁迫的反应分为两种情况一种是适应，另一种是适应性反应。适应是一种可遗传的饰变，其结果是增加植物在逆境环境中的存活和繁殖几率。而适应性反应是植物遭受胁迫后短期内、经诱导或刺激产生的特征，这种适应性特征通常不会被植物保留下来27。131植物旱害的主要原因自然条件和植物本身的生理条件是引起植物旱害的主要原因。这种旱害包括大气干旱、土壤干旱和由植物本身所引起的生理干旱。由于岩溶地区通常降雨较多，但土壤调蓄能力较弱，保水能力差，造成大量表层岩溶水表层岩溶水流失。另外，在这些地区，夏季温度较高、土壤及植物水分蒸发较快。因此该区域植物旱害是由土壤干旱引起的，且具有明显的季节性特点。132植物对干旱的适应对策水分胁迫下，植物为减缓由于缺水造成的压力，其生理代谢迅速作出调整以保证植物细胞的正常生理代谢功能。长期的进化过程中，演化出逃避干旱（短生植物）、髙水势延迟脱水耐旱（御旱植物）及低水势忍耐脱水耐旱（耐旱植物）及复原抗性等复杂的适应机制28。逃避干旱是指植物在赶在严重干旱胁迫之前完成其生活史。高水势延迟脱水耐旱是指在受干旱胁迫时，植物仍可通过自身的某些特征进行有效的水分吸收利用和减少水分散失，使植物保持高水势的能力。低水势忍耐脱水耐旱是指植物在受旱时，能在较低的细胞水势下维持其一定程度的生长发育和忍耐脱水的能力。复原抗性是指植物在经过一段时间干旱后的复原能力29,30。通常在遭遇干旱胁迫时，植物最直观的的表现为叶面积明显减小，叶表面角质化、蜡质化程度增大，叶片气孔关闭，以减少水分的丧失，有些树种会出现落叶现象（叶面积减小的极端形式）等形态变化的适应策略。133干旱胁迫对植物个体生长发育的影响植物对干旱胁迫的反应首先体现在其生长受到抑制。水分的亏缺直接影响到细胞的分裂、延伸及分化，其影响结果直接体现在植株大小及产量的降低。并且植物所受伤害程度与干旱胁迫出现时植物所处的发育阶段有直接关系。尤其是植物种子萌发及幼苗生长阶段比较脆弱，对逆境的抵抗力较成年阶段较弱，徐明慧31等对玉米抗旱性的研究发现。干旱胁迫下，玉米种子的发芽势、发芽率明显降低。幼苗阶段，干旱胁迫会影响细胞的分裂，从而明显抑制幼苗叶片的扩张。许育彬32等对甘薯的研究发现，干旱胁迫下，甘薯的叶片数减少，叶面积明显下降。史燕山33等对金叶过路黄、佛甲草、百里香等的研究发现，水分胁迫时，植物的生长量分别减少27CM。幼苗根系的生长情况是衡量植物抗旱能力的重要指标之一。一些研究认为，根系大、深、密是抗旱植物的基本特征。VIJAYALAKSHMI34等研究根系类型对水稻产量的影响时发现，耐旱品种有更好的根系穿透力和分布密度。景蕊莲35对小麦的研究认为根的数目较少，根的总干重中等，且根系较长的品种抗旱能力强。柴丽娜36对冬小麦的研究认为持续干旱条件下，根冠比比值越大，抗旱性越强。134干旱胁迫下植物的生理生化变化1341光合作用光合作用是植物赖以生存的生理基础。研究表明，干旱胁迫导致植物叶面积减小，导致植物光合速率降低，对植物光合系统产生不可逆的伤害。水分首先是光合作用的原料，但此部分水仅占植物吸收水分的极小部分。水分的主要作用是影响气孔的关闭及细胞中的代谢。所以在水分亏缺环境下，不仅仅会是植物光合速率下降，而且还会抑制光反应中原初光能转换、电子传递、光和磷酸化及暗反应过程37。干旱胁迫下植物的光合速率明显下降，其原因主要为以下两个方面一是气孔因素，即由于叶片气孔关闭而阻碍CO2进入叶内；二是非气孔因素，即由于得不到的CO2叶片继续照光造成光合器官的光破坏作用38,39。许多研究已证明，在严重干旱下，与光合作用有关的许多重要过程的活性或成分的含量降低，执行光合作用重要功能的各种色素蛋白复合体含量，以及吸收、传递和转化光能的叶绿素含量均减少，在光合碳同化过程起着极重要作用的RUBP梭化酶的含量及其活性都明显降低，叶肉细胞内的叶绿体排列出现紊乱，膜系统受到破坏等等，光合器官中发生如此强烈变化，必然导致光合速率下降。研究显示，干旱胁迫开始时会引起气孔阻力的增加，如若胁迫程度进一步加重，必然会导致气孔关闭，阻断外界CO2进入叶绿体，使植物的光合作用受到明显抑制。长期处于干旱环境中的植物，在光合速率光合作用的调节运转机制、光和途径等方面发生了适应性的改变，以更好地适应水分亏缺环境。WU40等人对侧柏的研究表明，种源不同二年生侧柏幼苗的净光合速率、光呼吸和CO2补偿点都存在显著差异。1342活性氧调节植物受到干旱胁迫时，细胞代谢紊乱，活性氧和自由自的产生与清除之间的平衡被破坏，活性氧、自由基的积累加速，是植物受到伤害甚至死亡。植物在进化过程中，出现众多代谢途径来抵御逆境带来的伤害，其中活性氧代谢系统正越来越受到人们的重视。在干旱胁迫下，植物体内会产生活性氧，同样会有活性氧自由基清除系统对干旱胁迫作出反应。其中酶促活性氧自由基清除系统的主要酶类有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）、还原型抗坏血酸过氧化物酶（ASP）等。SOD是最先发生反应的酶，处于保护系统的核心地位。时连辉等（2005）研究发现，在是以水分条件下SOD变化幅度较小，随胁迫程度的加剧，SOD活性呈现先升后降的趋势，在胁迫末期，SOD活性下降。闫成仁41等研究发现POD的作用于植物所受胁迫的时间长短有关，初期，POD可清除H2O2，减小H2O2对植物的伤害，末期，POD会参与活性氧的生成，使叶绿素降解，引起脂膜过氧化。CAT定位于线粒体、过氧化物体与乙醛酸循环体中，专一清除H2O2。常与SOD协同作用。可见单一的抗氧化酶或抗氧化物不足以抵抗干旱胁迫带来的伤害，只有整个活性氧调节系统协同起来共同抵抗氧化伤害。1343渗透调节渗透调节是植物忍耐和抵御干旱的一种重要生理机制，可作为选择作物耐旱品种的一种重要生理指标。植物通过渗透调节可在水分胁迫条件下维持一定的膨压从而维持气孔开放细胞生长和光合作用等生理过程的正常进行，渗透调节可以在水分亏缺时维持气孔的开放。渗透调节一般发生在程度较低或中度干旱胁迫的情况下，当干旱胁迫很严重时，渗透调节能力可能减弱或消失。渗透调节的主要物质有无机离子如K、CL、NA、CA2、MG2等和有机溶质如可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱等。其中脯氨酸是分布最广的渗透剂，具有较强的水合能力，也是较稳定的氨基酸，作为一种贮氨形式可防止游离氨积累对植物造成伤害，并作为能源和呼吸底物，参与叶绿素的合成，对植物起到保护作用。14钙与植物抗旱性的研究进展141CA在植物中的分布钙主要以果胶酸钙、钙调素蛋白和肌醇六磷酸钙镁等形态存在于植物细胞中；而柠檬酸钙、草酸钙等大量的有机酸钙则主要存在于植物液泡中42,43。细胞质中的钙主要与蛋白质等大分子结合，一般游离CA2浓度很低，仅为100200NM，以避免与细胞之内无机磷酸盐形成沉淀，影响细胞正常生理活动。除此外，细胞间隙、线粒体、微粒体、内质网等细胞器也是细胞内CA2的主要储存部位4244。其中，液泡是植物细胞内最大的CA库，是细胞质基质CA水平升高的重要来源之一45。细胞外的CA主要作为细胞壁的组成成分或分布在细胞间隙，作为植物细胞外最主要的CA库，其CA2浓度约为细胞质基质的1001000倍。142CA在植物中的功能钙是植物必需的营养元素之一，不仅参与植物细胞的结构建成，在生物有机体的生命活动中起着重要的作用，它参与有机体的生长、发育、衰老和病理等过程。研究表明，CA2能够连接细胞膜上磷酸盐和磷脂及蛋白质羧基，以提高细胞膜的疏水性，使膜结构稳定性增强，同时对其他例子进出原生质膜和选择性吸收有调节作用46。CA在维护植物细胞壁稳定方面有重要作用47。足量的CA可以与细胞壁和胞间层果胶质形成交联结构，以维持细胞形态和生理过程能够正常。同时，CA作为细胞的第二信使，在将细胞表面的刺激信号传递给细胞内部的过程中，几乎起着全能性的离子信使的作用48,49。CA是保卫细胞调节气孔开关的信号分子50。143CA对植物抗旱性影响CA在植物体内独特的结构和生理功能，使其在植物抗逆性方面发挥重要作用。研究表明，钙与维持细胞脂膜完整性、降低逆境下细胞膜透性、增加逆境下脯氨酸含量等多种抗逆境的生理过程有关。植物体中，CA作为偶联胞外信号与胞内生理生化反应的第二信使。在水分胁迫条件下植物细胞首先通过CA2的内流产生钙信号，在完成信号传递后，CA2再经H/CA2酶等反转运把细胞质的CA2重新运回钙库。CA对植物抗旱性的影响主要表现在以下几个方面。1431对植物生长状况的影响CA主要通过改善植物生长状况、刺激微生物活性、提高养分的吸收及利用效率等途径，促进植物根和也的发育。郭礼坤51等研究表明，在干旱条件下，CA能促进植物根芽伸长，起到加快出苗速度、提高发芽率、最终达到提高成苗率的作用。山仑52等对小麦萌发的研究也说明，经外源钙浸种能提高小麦在干旱条件下的萌发率，而在水分较充足的条件下，CA又会对萌发及种苗生长产生一定的抑制。1432对植物生理的影响植物对干旱的适应性在一定程度上与耐盐性类似，例如脱落酸、脯氨酸等渗透物质积累等。气孔的关闭是植物对干旱的最早反应，在脱落酸作用下植物体产生H2O2，激活CA2通道，使质外体中的CA2进入细胞质，从而使K、CL等外排，气孔关闭。即使是气孔关闭过程对脱落酸等不敏感的植物种类，高量CA2也能使其气孔关闭5355。另一方面，钙能使植物保护酶活性和抗氧化物质的含量保持在较高水平，同时抑制干旱胁迫下植物丙二醛积累，提高植物在干旱胁迫下对活性氧的清除能力，抑制膜脂过氧化作用。5658。研究表明，干旱胁迫下，缺钙植物的含水量迅速降低，说明钙有益于维持植物的水分状况59,60。其原因概括为1钙能提高干旱胁迫下气孔阻力，降低蒸腾速率47；2钙能提高植物叶片的保水能力61。此外，施钙适当提高植物体含钙量，能改善干旱胁迫下植物的光合作用62，提高叶片CO2羧化效率，推迟光合作用由气孔限制向非气孔限制的转变47。从而使植物光合反应系统对干旱胁迫具有较高的抗性。1433CA对植物的毒害作用钙元素虽然在植物体内具有重要的生物学作用，但他在生物体细胞质内的含量是极低的（约为106107MOL/L），而起只有保持在极低状态，才能发挥正常生理功能。CA2浓度过高时，会使植物细胞的伸长受到抑制。同时CA2影响叶绿体内2,6二氯酚靛酚（DCIP）的光还原的重要因子，但CA2浓度过高，会引起同磷酸反应产生沉淀，干扰能量代谢。若细胞内游离钙浓度超过104MOL/L，就会引起植物的死亡54。15研究背景及意义151研究背景重庆市中梁山海石公园（293910295053N，10618141065653E）属于亚热带季风气候区，雨量充沛，热量丰富，常年平均气温168，年均降水量为1088MM。属中度石漠化区。进行生态修复建设前，岩石裸露，植被稀少。自1989年进行生态修复以来，引进多种植物进行绿化荒山建设，例如常绿阔叶树天竺桂、女贞、香樟、大叶樟等；落叶阔叶树复羽叶栾树、香椿、构树、刺桐、杨树等；针叶树种柏木、马尾松、雪松、杉木；灌木火棘、南天竹；草本层芒、白茅等。多年实践证明，并非所有移栽的树种都能适应石灰岩地区。事实证明，常绿树种中天竺桂、香樟适宜在该区域生长；而女贞则表现较差，主要体现在生长缓慢、叶片稀疏、叶面积小等。落叶树种中刺桐表现最差，成活率较低；杨树属北方树种，引种入石灰岩地区后，虽能成活，但生长状况不佳；香椿和复羽叶栾树则表现了较强的适应性。尤其是复羽叶栾树，其大树生长状况良好，特别是在石灰岩地区季节性干旱发生时表现出较强的适应性，其种子落入土壤后能较好的萌发，幼苗生长正常。近年来，关于石灰岩地区植物的适应性研究越来越受到人们的关注。研究较多的树种多为常绿树种、针叶树种。例如，刘锦春63对十大功劳的研究，金静64对木豆的研究，何跃军65对构树的研究，刘锦春66对柏木的研究等。但对于落叶树种适应石灰岩地区高钙、季节性干旱的研究较少。152研究意义通过对复羽叶栾树种子萌发及幼苗在钙离子作用下抗旱性的表现特征，总结钙离子在石灰岩地区植被的抗逆性中的作用。为今后的研究及石灰岩地区生态修复等实践工作提供基础理论。153研究物种复羽叶栾树（KOELREUTERIAPANICULATA），又名灯笼树，系无患子科落叶乔木，可生长于石灰石风化产生的钙基土壤中。其树形高大，枝叶茂密，抗污染、抗病菌能力强，是理想的景观绿化树种，是工业污染区的指示树种67，也是石灰岩地区荒山绿化的优良先锋树种。国家AAA级风景区重庆中梁山海石公园石漠化区于1989年引种复羽叶栾树，因其具有高抗旱性和高成活率，对石漠化地区典型的季节性水分亏缺环境有很好的适应能力，在石漠化的植被恢复重建中有极高的推广价值。但是，复羽叶栾树现有资源少，产籽量有限，种子出苗率在20左右68，限制了复羽叶栾树的发展。16拟解决的科学问题1高钙及干旱环境条件对复羽叶栾树种子萌发和幼苗生长、生理生化特征指标的影响2高钙及干旱环境条件对复羽叶栾树幼苗解剖形态特征的影响3外源钙离子是如何提高复羽叶栾树幼苗的抗旱性的17技术路线种子栾树幼苗（1A）培养皿滤纸法进行萌发实验2012年8月生理指标测定及数据分析田间最大持水量的测定PEG模拟干旱CACI2模拟高钙环境统计分析外源钙对干旱条件下发芽率的影响外源钙对干旱条件下发芽势的影响外源钙对干旱条件下发芽指数的影响外源钙对干旱条件下活力指数的影响外源钙对干旱条件下幼苗生长的影响复羽叶栾树外源钙对干旱胁迫下复羽叶栾树种子萌发的影响移栽入盆适应生长半年外源钙处理石灰岩地区土壤中游离钙含量测定干旱处理对生长的影响对光合作用影响对活性氧调节物质的影响对渗透调节物质的影响对根系水分疏导组织的影响外源钙对干旱胁迫下复羽叶栾树幼苗抗旱性的影响外源钙对重庆石灰岩地区复羽叶栾树幼苗抗旱性的影响第二章外源钙对干旱胁迫下复羽叶栾树种子萌发的影响21前言种子是植物生活史中的重要阶段，也是进行植物抗旱性研究的重要时期。相对植物成年阶段,植物种子在萌发、幼苗生长阶段比较脆弱，抵抗力不强，加上常常暴露于恶劣的地表或近地表区域，周围环境的温度和湿度表现出较大的波动性，更容易受到较多的环境胁迫，死亡率相对较高。种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等均是反映种子发芽能力的重要指标。在某些情况下，发芽率与种子活力是一致的，这也是在生产上通常将种子的发芽率作为鉴定种子质量的重要指标之一的原因；但更多的情况是,常规的发芽试验得到的发芽率既不能与田间出苗率相符，也不能标志种子质量的实际水平69。而发芽指数反映了种子发芽的速率和整齐程度，种子活力是种子在较广的范围内能否迅速生长以及生长的整齐度种子发芽指数和活力指数越高，种子发芽速度越快，整齐度越好，在较广的范围内就越能迅速生长69。本研究以复羽叶栾树种子为对象，研究了石灰岩地区土壤中交换性钙离子对干旱条件下复羽叶栾树的种子萌发和幼苗生长的影响。22研究地区与研究方法221研究区概况试验用复羽叶栾树种子采自地处中度石漠化区的重庆市中梁山海石公园（293910295053N,10618141065653E）7072。该地区属于亚热带季风气候区，雨量充沛，热量丰富，常年平均气温168，年降水量为1088MM。目前,山上主要存在2种植被分布情况1为通过群落次生演替形成的灌丛2为自然演替和人工恢复所形成的呈垂直分布的草本、灌木和乔木。部分地区土层较薄，土质贫瘠，为亟待进行生态恢复的喀斯特地区。222试验方法2221试验设计2012年2月25日,选取成熟充分、颗粒饱满，活力正常的复羽叶栾树种子，自然条件下风干，带回室内，低温（5）保存至2012年3月1日。试验采用双因素析因设计，共设25个处理，每个处理3个重复，每个重复25粒种子。设外源钙离子CACL2浓度梯度为0（CK）、15、20、25、30MMOLL1，标记为A0、A1、A2、A3、A4；利用聚乙二醇（PEG6000）配成不同水势的高渗溶液模拟干旱，设置5个PEG6000浓度梯度0（CK）、5、15、25、30，标记为B0、B1、B2、B3、B4，其中，5和15条件下的水势相当于轻度干旱，25相当于中度干旱，30为重度干旱69。处理方案如表21所示。表21试验处理方案TAB21TREATMENTSOFTHEEXPERIMENT2222种子萌发试验采用培养皿滤纸法73进行种子萌发试验。选取大小均一、籽粒饱满的复羽叶栾树种子1875粒，洗净后于水中浸泡48H，使种子吸胀；用04高锰酸钾消毒610MIN，流水冲洗3次，再用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干种子表面水分，每25粒置于D100MM铺设2层滤纸的培养皿中。分别向培养皿中加入预先配制好的不同浓度的PEG6000和CACL2溶液，以蒸馏水为对照。恒温培养箱中在25昼/15夜和周期性光照（12H昼/12H夜，光强100MOLM2S1）条件下萌发。萌发过程中，每周期后用对应浓度的溶液冲洗种子23次，以确保培养皿中的溶液浓度维持恒定。34个周期更换一次滤纸，防止种子霉变。2223种子萌发参数的统计和测定种子于2012年3月1日置床。从置床第2天开始统计种子萌发情况，试验持续15D，直至连续3D无种子萌发结束。将胚根突破种皮视为萌发，分别统计并计算出种子萌发的特征参数。幼苗鲜质量将同一天萌发的幼苗做好标记，待试验结束时，用滤纸小心擦干其表面水分，用万分之一天平精确称量。种子发芽率（GR）15D内发芽种子数/供测种子数100。发芽势（GP）前5D正常萌发的种子数/种子总数100发芽指数（GI）MDGPV式中MDG为平均每天种子萌发数,即萌发试验结束时种子萌发数/萌发试验经历的天数PV为种子最大萌发速率,即试验期间任意一天中达到的最大萌发数/达到最大值所需的天数74CZABATORFJ1962）。种子活力指数（VI）幼苗生长势（幼苗鲜质量）GI。CACL2PEGCK（A0）A1A2A3A4CK（B0）CKA1B0A2B0A3B0A4B0B1A0B1A1B1A2B1A3B1A4B1B2A0B2A1B2A2B2A3B2A4B2B3A0B3A1B3A2B3A3B3A4B3B4A0B4A1B4A2B4A3B4A4B4223数据处理所有数据均采用SPSS160软件处理，采用双因素方差分析和最小显著差异法LSD比较不同数据组间的差异，显著性水平设定为005；利用ORIGIN8软件作图。23结果与分析231不同处理的复羽叶栾树种子萌发状况表22各处理组种子的萌发及幼苗鲜重状况TAB22SEEDGERMINATIONANDINEACHGROUP组别GROUP发芽率GERMINATIONRATE发芽势GERMINATIONPOTENTIAL发芽指数GERMINATIONINDEX活力指数VIGORINDEX幼苗鲜质量FWCK（A0B0）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由表22可以看出，干旱胁迫使复羽叶栾树种子的萌发特征参数出现明显减小趋势；当对各PEG处理组施加外源钙后，中低浓度的钙离子能显著补偿种子萌发过程中因干旱所造成的损失。232外源钙离子和干旱胁迫对复羽叶栾树种子萌发特征的影响双因素方差分析结果表明（表23）不同浓度外源钙离子、不同程度干旱胁迫，以及两者的交互作用对复羽叶栾树种子的发芽率、发芽势及发芽指数都有影响，而两因素的交互作用对种子活力指数的影响无统计学意义。表3双因素分析结果TAB23TESTSOFBETWEENSUBJECTSEFFECTS来源SOURCE因变量DEPENDENTVARIABLEFSIG发芽率301080000发芽势51500001发芽指数51410002CACL2活力指数39780007发芽率864390000PEG发芽势270500000发芽指数195690000活力指数137220000发芽率57510000发芽势20130031发芽指数22910013CACL2PEG活力指同浓度外源钙离子对复羽叶栾树种子萌发和幼苗生长的影响由图21（数据见表22）可以看出,随着外源钙离子浓度的增加，复羽叶栾树种子的发芽率整体呈现先增加后下降的趋势。与对照CK相比，15MMOLL1CACL2处理下的种子发芽率无明显差异；20MMOLL1CACL2处理，种子发芽率增加了10；当外源钙浓度增加到25和30MMOLL1时，发芽率分别降低了21和68。而外源钙离子浓度的增加不会对复羽叶栾树种子的发芽势产生影响。随着外源钙离子浓度的增加,种子的发芽指数和活力指数均呈现下降趋势。其中,外源钙离子浓度为25和30MMOLL1时，其发芽指数分别下降了576和804，活力指数分别降低了473和867。这说明适宜浓度的钙可促进种子的萌发，而高浓度的钙抑制了种子的萌发。不同浓度外源钙离子对幼苗的鲜质量有一定的影响。随钙离子浓度的增加，幼苗鲜质量呈现先增加后降低的趋势。15和20MMOLL1CACL2处理下幼苗的鲜质量分别比CK增加了436、491；25MMOLL1CACL2处理增加28；而在30MMOLL1CACL2处理下，幼苗鲜质量只有CK的687。可见中低浓度外源钙离子对幼苗的生长有一定的促进作用。A0B10A2B030A4B0501502503DCBA发芽率GR处理TREAMNA0B10A2B030A4B02046081021406AAA发芽势GP处理TREAMNA0B10A2B030A4B0501502503504A发芽指数GI处理TREAMNABCA0B10A2B030A4B0204608102A活力指数VI处理TREAMNABCA0BA1B0A2B0A3B0A4B05015025035045B鲜重FW/G处理TREAMNABCD图21不同浓度氯化钙溶液对复羽叶栾树种子发芽参数及幼苗鲜质量的影响FIG21EFFECTOFDIFFERENTCACL2CONCENTRATIONSONTHEGR、GP、GI、VIANDSEEDLINGFWOFKOELREUTERIAPANICULATAMEANSE不同小写字母表示各处理组差异显著（P005）,下同。VALUESFOLLOWEDBYDIFFERENTSMALLLETTERSINDICATEDSIGNIFICANTDIFFERENCEAT005LEVELINFIGURETHESAMEBELOWA0B01A0B203A0B4051052053发芽率GR处理TREAMNABCDA0B01A0B203A0B42046081021406B发芽势GP处理TREAMNABA0B01A0B203A0B4501502503504B发芽指数GI处理TREAMNACA0B01A0B203A0B4024068012B活力指数VI处理TREAMNACA0BA0B1A0B2A0B3A0B4051052053C鲜质量FW/G处理TREAMNABC图22PEG浓度变化对复羽叶栾树种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数及幼苗鲜质量的影响FIG22EFFECTOFDIFFERENTPEGCONCENTRATIONSONTHEGR、GP、GI、VIANDSEEDLINGFWOFKOELREUTERIAPANICULATAMEANSE234PEG浓度变化对复羽叶栾树种子萌发和幼苗生长的影响由图22（数据见表22）可以看出，复羽叶栾树种子发芽率随着干旱胁迫的加剧（PEG浓度的增大）而降低，且各组间表现出显著性差异。与对照CK相比，在5、15、25PEG处理下，发芽率分别降低316、474、735，而在30PEG处理下种子无萌发。种子发芽势随PEG浓度的增大而降低，5、15、25PEG处理下，种子萌发的高峰期晚于对照，与对照相比，分别降低了545、637、545，各处理组间无差异。随着PEG浓度的增大，种子的发芽指数、活力指数都出现明显的较低。在5、15、25PEG处理下，发芽指数分别降低了80、787、886；活力指数分别降低813、887、952。幼苗的鲜质量随着PEG浓度的增大呈递减趋势。5、15、25PEG处理下鲜重明显小于对照，较CK组分别减小165、52、622。且15PEG处理组与20PEG处理组间没有显著性差异。235交互作用对复羽叶栾树种子萌发及幼苗生长的影响双因素分析结果表明两因素的交互作用对复羽叶栾树种子的发芽率、发芽势、发芽指数及幼苗鲜重的影响具有统计学意义（P005）表23。由表26知，交互作用对种子在干旱环境下的发芽率有一定补偿作用。当PEG浓度为5时，A0B1组种子发芽率明显降低，仅为173，通过15MMOLL1、20MMOLL1、25MMOLL1CACL2的处理后，发芽率恢复到CK水平。但当CACL2浓度为30MMOLL1时，种子发芽率较A0B1组降低了769。PEG浓度为15时，15和20MMOLL1CACL2组发芽率较A0B2组均增加了509，但均未能恢复到对照水平，25和30MMOLL1CACL2组萌发困难。PEG浓度上升到25时，15和20MMOLL1CACL2组发芽率较A0B3呈明显先上升后下降趋势，25和30MMOLL1CACL2组萌发困难。而在30PEG处理下，CACL2浓度的增加不能是种子萌发。由表26可知，交互作用对种子发芽势的影响，在同一浓度PEG处理时，CACL2浓度的增大减缓了干旱胁迫对种子发芽势的影响，A1B1、A3B1组及A1B2、A3B2组种子发芽势都显著高于A0B1和A0B2组；当PEG达到及超过25时，CACL2浓度达到25MMOL/L之后，种子无萌发。从种子发芽指数考虑，在同一浓度PEG处理下，适宜浓度的CACL2溶液使种子发芽指数明显增加，显著高于单一PEG处理时的发芽指数，甚至达到CK水平。但过高的钙离子浓度会降低种子的发芽指数。从总体上看特定干旱条件下，经15MMOLL1、20MMOLL1、25MMOLL1CACL2处理，可减缓种子萌发过程中因干旱所造成的损失，但钙离子浓度过高（30MMOLL1）可能不会表现出这种补偿作用，甚至使种子的萌发参数表现更差。种子萌发后，在一定的干旱环境下，中低浓度CACL2溶液显著性的增加了幼苗的鲜质量，使幼苗鲜质量明显大于单一干旱处理时的鲜质量，甚至达到或超过CK水平。说明在特定的干旱环境下，一定浓度的外源钙离子能增大幼苗生物量的积累，增强对干旱环境的适应；而钙离子浓度过高时，则会产生相反的效应。表26两因素交互作用对复羽叶栾树种子发芽参数及幼苗鲜质量的影响TAB26EFFECTOFINTERACTIONOFDOUBLEFACTORSONTHEGERMINATIONPARAMETERSANDSEEDLINGFWOFKOELREUTERIAPANICULATAMEANSE发芽率GERMINATIONRATE发芽势GERMINATIONPOTENTIAL发芽指数GERMINATIONINDEX鲜质量/GFW/GA0B0（CK）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讨论分子量6000及以上的PEG是模拟土壤干旱的理想水势调剂物质75，其最大的特点是本身不能穿越细胞壁进入细胞质，因而不会引起质壁分离，使植物组织和细胞处于类似于干旱的水分胁迫之中76。本文以不同PEG6000浓度来分别模拟复羽叶栾树种子所处的不同水分环境。研究发现随着PEG浓度的增大，种子的萌发率降低、萌发高峰期推迟、发芽指数和活力指数降低，这与施积炎和丁贵杰77、李振基和宋爱琴78对马尾松（PINUSMASSONIANALAMB）、木荷（SCHIMASUPERBAGARDNETCHAMP）等对干旱胁迫的响应研究结果基本一致。幼苗鲜质量也随着PEG浓度的增加而减小。当PEG浓度过高时（25），种子发芽较少或基本不萌发。在植物必需元素中，钙离子具有极其特殊的作用，它不仅作为细胞的结构物质，而且作为第二信使，调节植物对环境变化的响应过程。利用CACL2溶液设置不同的外源钙离子浓度梯度处理复羽叶栾树种子。结果发现中低浓度的外源钙并未对种子的萌发参数产生明显的影响，这与韦小丽79对马尾松种子萌发的研究结果相矛盾，这可能与实验中所用浸种方式有关，中低浓度的外源钙处理却明显的增加了幼苗的鲜质量；而高浓度的外源钙明显降低了种子的发芽率、发芽指数及活力指数，与徐萌80研究认为高浓度钙离子能抑制春小麦种子吸水和萌发，抑制了胚芽和芽鞘的伸长基本一致，同时，如表4中钙离子浓度变化与种子发芽率之间可能存在一定的线性关系，但由于实验中所设CACL2溶液梯度的不均匀，两者的相关性并未得到很好地体现，这一点有待后续进行深入研究。另一方面，中低浓度的钙离子增大了幼苗鲜质量，增大了成苗率，而高浓度的外源钙则其相反的效果。在环境胁迫下，钙和钙调素参与胁迫信号的感受、传递、响应与表达，提高植物的抗逆性81。许多研究表明，钙离子参与种子的萌发82，调控与萌发有关的重要生理过程和酶活性83。向各干旱处理组中施加一定浓度的外源钙时发现，同一干旱胁迫水平下中低浓度的CACL2能显著增加种子的发芽率、发芽势、发芽指数及幼苗的鲜质量，表明在种子萌发过程中由于干旱胁迫造成的损失，通过施加一定浓度的外源钙可以得到补偿。这与袁清昌84的研究结果相似说明细胞外钙离子除具有稳定和保护细胞质膜结构和功能的作用外，还对植物种子萌发过程中代谢产生影响。因此，适宜浓度的外源钙能缓解干旱胁迫对种子萌发过程所造成的伤害。干旱胁迫下种子发芽、幼苗生长特性对幼苗生存具有十分重要的意义8587。研究表明一般野生的旱生、超旱生植物种子大多具有独特地萌发特性，以适应干旱缺水的环境85,8789。而针对岩溶地区土壤中钙的高富集性，可能在植物的逆境生理所起的作用并未进行深入的研究。岩溶地区土壤中的游离钙离子含量通常随着石漠化强度的增加表现出递增趋势1，加之土壤中微生物群落数量减少、有效N、P含量降低、土壤粘性增加等环境因素，表现出重度石漠化地区对植物的选择性强于中度石漠化和轻度石漠化区域；因此如何在生态修复进行中综合不同的岩溶生态环境因素，筛选出适应不同石漠化程度的优选植物，避免因植物选择不当而造成人力物力的损失，优化岩溶地区生态修复过程中的植被配置方案等将是我们今后工作与研究的主要方向。第三章外源钙对干旱胁迫下复羽叶栾树幼苗生长的影响31引言植物对干旱胁迫的生态反应具有整体性90。在胁迫发生时，植物各器官的生长发育都会受到一定程度的限制，抑制的是植物细胞的增大、分裂、伸长，使细胞的增殖受到影响，造成植物地上生物量的急剧减少，以防止水分从叶部分的过多消耗91。植株生长速度减缓，而根系生长速度快于正常供水时，这种适应性变化，保证了植物在干旱条件下吸收更多的土壤水分。研究表明，在正常供水时，植物地上部分与地下部分生长比例基本相似92，干旱胁迫时，植物生物量分配的改变有助于其适应环境的变化。通过植物地下部分与地上部分生物量比率大小来反映植物对环境因子的需求和竞争能力的大小93。复羽叶栾树在石灰岩地区季节性干旱过程中表现出非常明显的“减叶反应”，即在干旱胁迫发生时，其叶片纷纷凋落，极大的减小了叶面积，使其地上部分生物量减小明显。利用这种策略，提高了植物的保水能力。本章重点研究复羽叶栾树幼苗在干旱胁迫发生时的生物量分配问题，以及外源钙在生物量分配中所起的作用。32材料与方法321实验地点及材料2011年10月至2012年9月在重庆市西南大学生命科学学院生态学实验基地进行。一年生复羽叶栾树幼苗120株，平均高约35CM；取自重庆市中梁山海石公园19（E10618141065653），为重度石漠化地区70。供试土壤为中梁山海石公园山地黄壤，其基本理化性状为PH73，有机质含量12804G/KG，碱解氮含量679MGKG，速效磷5MG/KG，测得田间持水量为336。322方法与实验设计2012年2月将苗木移入雨棚下（四周通风）。实验分为两组无钙对照组和钙处理组。无钙对照组按不同干旱条件分为对照组CK（田间持水量的田间持水量的7580）、轻度干旱LS（田间持水量的5055）、中度干旱MS（田间持水量的3540）、重度干旱组SS（田间持水量的2530）；钙处理组对应无钙组分别为GCK、GLS、GMS、GSS组。每组15个重复（如图31）。土壤含水量采用称重控水法进行控制，即在对苗木停止供水的第二天起，每天1600时用管状取样器取苗木盆中的土壤测定含水量的变化情况，以确定停止浇水后个处理达到实验设计要求的土壤含水量。取样时尽量靠近盆的中央区，每盆取样三个，测定含水量并求其平均值，当土壤含水量达到预定值时，用天平称重量（WTC），之后每天1600称盆重、苗木及土壤总重量（WTT），由于蒸腾、蒸发作用，使土壤含水量降低，因此每天需对供试苗木盆中补水，补充水分（WTM）WTCWTT。图31试验区组设计FIG31THEEXPERIMENTALGROUPDESIGN2012年3月开始进行外源钙处理。处理方法对钙处理组进行外源钙处理。利用钙溶液浇灌每天用35MMOL/LCACL2浇灌，持续时间110天（试验期间在花盆底部放置托盘，将渗出溶液回倒入土壤中，以防止水分和盐分的丧失）。2012年7月进行干旱处理。323测定指标分别于开始干旱处理当天、第二周、第四周、第六周测定各处理组幼苗株高、基茎并作详细记录。324数据处理所有数据均采用SPSS160进行数据处理分析，进行ANOVA方差分析并进行DUNCAN多重比较；利用ORIGIN80进行处理作图。33结果与分析331外源钙对干旱胁迫下复羽叶栾树幼苗株高、地茎的影响如图32A，胁迫初期，幼苗株高并不会随胁迫强度的加剧而发生变化。胁迫中期LS、MS、SS组间无差异，但幼苗均高度显著低于对照。胁迫末期，随干旱强度的加剧，复羽叶栾树幼苗株高呈递减趋势，且各处理组间均表现出显著差异，与对照相比，分别减小684、838、956（数据见附表1）。外源钙处理后，胁迫初期，GCK组幼苗株高显著高于对照，其余各干旱组均维持在对照水平。胁迫中期，GCK组幼苗株高显著高于对照；GLS、GMS组与对照无差异；但GSS组与SS组相比，高度虽然有一定程度的增加，但仍显著低于对照。胁迫末期，除重度干旱组外，其余干旱强度处理组经钙处理后植株高度均能达到对照水平（图32B）（数据见附表1）。2WEKS4WEKS6WEKS0120340560BAAA植株高度PLANTHEIG（CM）处理时间TRAMNI（）CKLSMCD2WEKS4WEKS6WEKS0120340560DCABCBAA植株高度PLANTHEIG（CM）处理时间TRAMNI（）CKGLSGMSGSGABB图32外源钙对干旱胁迫下复羽叶栾树幼苗苗高的影响（平均值标准误）FIG32EFFECTSOFWATERSTRESSONPLANTHEIGHTOFKOELREUTERIAPANICULATAWITHEXOGENOUSCA2MMS如图33A，胁迫初期、胁迫中期复羽叶栾树幼苗地径均呈现先减小后增大的趋势。胁迫初期，各干旱处理组与对照相比，幼苗地径分别减小143、531、286。胁迫中期分别为776、1238、1128。在胁迫