野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究

山东农业大学硕士学位论文CRYOGENICSTRESSTHEEXTENSIONOFTIMEWITHARISINGTRENDOFFINALLYDROPPEDFIRSTRISESIGNIFICANTLY,COMPREHENSIVEASSESSMENTXIAOMILAWILDCHILIRESISTANTTOHIGHABILITY,ALLINDEXESISSUPERIORTOOTHERCHILICHAOTIANJIAOBELLPEPPERS,SECONDHIGHTEMPERATURERESISTINGCAPACITYISBETTERALSO,OXHORNPEPPERMOSTNOTHIGHTEMPERATURERESISTANTSUFFERSERIOUS5EARLYSPRINGCULTIVATION431XM,419XM,STRONGBADSEEDS,LIGHTHAIRED,EMBRYOSWASNOTCOMPLETEHZXMCAPSICUMFRUTESCENSVARHZANDWILDCHILIOFXIAOMILAEARLYSPRINGCULTIVATIONCANUSEHZXMEARLYSPRINGCULTIVATIONWITHVARIOUSINDEXESOFCHAOTIANJIAOHZDIFFERENCEISBIGGER,INCOMPATIBILITIESWITHPATERNALWILDCHILIMISCOMPAREDDIFFERENCESKEYWORDSCHILI；DISTANTHYBRIDIZATION；HIGHTTEMPERATURE；LOWTEMPERATUREPHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICAL3英文缩略词英文缩写CATCKCMDLMOLPROGMGH2O2MDAMMINMLNBTPOD英文全称DEGREECENTIGRADECATALASECONTROLCENTIMETERDAYLITERMOLEPROLINEGRAMMILLIGRAMHYDROGENPEROXIDEMALONDIALDEHYDEMETREMINITEMILLILITRENITROBLUETETRAZOLIUMPEROXIDASE中文名称摄氏度过氧化氢酶对照厘米天升摩尔脯氨酸克毫克过氧化氢丙二醛米分钟毫升氮蓝四唑过氧化物酶1O2SINGLETOXYGEN单线态氧SODSUPEROXIDEDISMUTASE超氧化物歧化酶关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名导师签名日期野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究1引言辣椒CAPSICUMFRUTESCENSL为茄科植物，辣椒的果实，又叫番椒、海椒、辣子、辣角、秦椒等，是一种药食同源的蔬菜，主要用于菜肴、调料，通常成方形、圆锥形和长圆形，未成熟时呈绿色，成熟后变成鲜红色、黄色或紫色，以红色最为常见。辣椒植物的种植遍布世界各地，可在不同的土壤和气候下生长，一般每年710月果实成熟时采收，因各地气候、地理位置、土壤类型及栽培方式的不同形成了形状、辣度、口感各异的多品种辣椒。辣椒营养价值很高，含有人体需要的碳水化合物、蛋白质、维生素、色素和钙、磷、铁矿物质及人体需要的15种氨基酸。辣椒的维生素C含量在蔬菜中占首位，是番茄的7倍。现在辣椒已成为我国栽种最普遍的蔬菜并列入十大蔬菜的行列。2003年我国辣椒单产能达1000KG/亩，干辣椒出口量约为国际贸易量的一半，产量居世界第一。特别在我国陕西、四川、河南、贵州、福建、山东、湖南等省有着广泛的农产品资源优势（王永平等，2009）。辣椒一年生草本植物，栽培地区非常广泛。随着辣椒周年生产和周年供应技术的出现，早春和晚秋的低温冷害成为影响辣椒正常生长，制约辣椒越冬和早春栽培的主要障碍因子。辣椒对温度反应敏感，15时生长发育迟缓，10时光合作用停止，10以下发生冷害。很多时候，低温往往对辣椒造成更大的危害，尤其在冬春保护地生产中，低温给辣椒生产造成不可挽救的损失（胡文海等，2001）。辣椒虽然是喜温植物，但在辣椒栽培中，高温对辣椒生长也有影响。辣椒生长发育适宜的温度范围为白天2027，夜间1518，超过35则生长发育受阻，发生落叶、落花现象，结果能力随之下降，产量锐减。而设施内气温有时则高达40以上。人类活动导致全球气候变化加速，和全球一样，21世纪中国地表气温将继续上升，而冬天温度却呈降低趋势。设施栽培中高温或低温成为限制蔬菜产量和品质的重要因素。解除高温，低温限制的根本措施是培育耐高温、抗低温品种。而培育耐低温抗高温品种的首要问题是，必须深入了解蔬菜在高温，低温逆境下的生长变化和生理特性，摸清其在低温，高温下的生长发育秉性，找出与耐高温、耐低温性相关的性状和指标，针对性地进行耐高温、抗低温品种的筛选和培育。用生产上的辣椒栽培间进行杂交培育耐高温、抗低温品种很难选出生产上需要的耐高温、抗低温品种。近年来，有关作物对低温单一逆境胁迫的研究报道较多，而对高温胁迫的研究却见诸甚4山东农业大学硕士学位论文少。课题选用野生辣椒与常规品种杂交的远缘杂交方法，研究辣椒高温、低温条件下生理生化指标，为筛选和应用耐高温、低温的辣椒种质资源提供理论依据。11野生辣椒与普通辣椒远缘杂交及意义远缘杂交是指亲本间亲缘关系比较远的杂交。通常把种以上分类单位植物间的杂交称为远缘杂交，它包括种间杂交、属间杂交等。在地理上远缘的种族、不同生态类型和系统发育上长期隔离的植物品种或亚种之间的杂交，称为地理远缘杂交或地理远距离杂交。远缘杂交在种的形成、进化、引种等内容上具有很重要的意义。通过远缘杂交，可以提高品种的抗病、抗虫、抗旱、抗热抗寒、抗盐碱、抗倒伏等抗逆能力。利用远缘杂交，有时可以体现出较强的杂种优势，获得增产幅度大、品质优良的杂种。远缘杂交种往往比品种间杂交种具有更强大的杂种优势。利用远缘杂交，可以从杂种后代中选育出雄性不育系。远缘杂交后代中，往往出现完全不育和半不育植抹，这为我们寻找、培育雄性不育系提供了条件。通过远缘杂交找出雄性不育植株，再用相应的回交方法把雄性不育特征转育到栽培品种中去。通过远缘杂交，可以培育出自然界从来没有过的新种、类型和品种。远绦杂交可以从根本上改造原有的植物特性并创造出新的作物。在远缘杂交中，利用有亲缘关系的野生植物与栽培作物杂交有很大的意义。许多野生植物，由于长期自然选择的结果，对于各种不良的外界环境条件具有很强的适应性，它们作为亲本与栽培品种杂交时，杂种后代往往可以获得卓越的抗逆性。12国内外辣椒远缘杂交的研究现状据中国植物志和云南植物志记载，中国辣椒种质资源分属于CAPSICUMAMNUM和CAPSICUMFRUTESCENS两个种。目前生产上广泛应用的栽培种基本属于CAPSICUMAMNUM，而CAPSICUMFRUTESCENS的变种很少。19791980年中国农业科学院蔬菜花卉研究所和云南省农业科学院园艺研究所在云南省进行蔬菜种质资源考察时，发现西双版纳等地分布有野生小辣椒，并鉴定CAPSICUMFRUTESCENS的一个新品系。小米辣CAPSICUMFRUTESCENS为野生种（龙洪进等，2004）。野生小米辣在长期自然选择的压力下，逐步演化出了耐高温潮湿的特点，抗病性也随之增强。土壤选择的压力又使得小米辣养成了耐瘠薄的特点，长期生长于树荫下还使得小米辣具有了耐低温弱光的特性。5野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究由于国内外辣椒属种间杂交成功及进一步深入研究的报道不多，尤其是源于中国的种质资源仅有2个。栽培种CANNUUM及野生椒（CFRUTESCENS种间杂交研究更少，然而，现有的育种模式导致遗传基础日趋狭窄，因此，应加大利用辣椒属种间杂交创制新种质材料的研究力度，对改善现有辣椒栽培品种的品质有着重要的意义。13辣椒的生产现状全世界辣椒发展历史悠久，不同地区的人们都有食辣习性，食辣已成为一种潮流。亚洲是世界主要食辣区，欧洲和美国也是主要消费区域，其中以我国及东南亚为主，韩国、日本、泰国等都是主要的生产国和消费国。据统计，全世界食辣人口已超过30亿，贸易量近300亿美元，辣椒种植面积也在不断扩大。全世界辣椒生产分布不均匀，亚洲占据优势地位，印度和中国是世界上的辣椒生产大国，面积和产量占世界的34左右。2002年全世界辣椒栽培面积为20012HM2，产量23129万T。日本和韩国辣椒单产占世界领先水平。美国年贸易量占世界辣椒总贸易量的21，成为最大的进口消费国。美国、日本等发达国家从中国、印度低价进口辣椒，提取辣椒素后高价销往各地。墨西哥是最有代表性的食辣国家，辣椒被视为国食。同时辣椒在印尼、爪哇、泰国、越南、巴西、古巴等国家都逐渐发展成为主要产业。全球出口辣椒较多的国家有中国、印度、西班牙、马来西亚、越南等。印度辣椒产业发展迅速，其干椒年产量110万吨左右“SANAM”是印度最著名的辣椒品种。印度辣椒加工业主要体现在具有民族风味的辣椒食品上，其生产的辣椒粉、红辣油等都是具有高附加值的产品（李晴等，2009）。辣椒是重要的蔬菜作物之一。自2000年以来,中国辣椒种植面积一直在13106HM2左右。随着高效农业的推进，我国辣椒生产迅速发展，栽培面积不断扩大，储藏加工稳步发展。我国食辣人群高达40，国内辣椒贸易量达980亿元以上。干制辣椒成为我国的名优特产也是重要的出口创汇产品。目前，我国辣椒种植面积仅次于白菜居蔬菜作物第二位，产值和效益则高于白菜而雄居蔬菜作物之首。目前辣红素和辣椒碱市场前景广阔，辣红素是世界销量最大的天然色素，市场每年需求量大约8000T，我国辣椒碱年产量200T左右。据对陕西、四川、贵州、湖南、湖北等红辣椒主产区市场调查显示，2003年至今，红辣椒市场前景广阔，国内外市场销量及价格均有增加。近年来，国家加大农业投入，全国辣椒总产量有所增加。一批有影响力的品牌产品和6山东农业大学硕士学位论文龙头企业相继诞生，提高了辣椒精、深加工产品比重，促进了辣椒产业化发展（钟利等，2008）。14辣椒耐逆研究现状高温和冷害是影响辣椒生长发育的重要环境因素。春季早熟栽培和秋延后栽培辣椒常受到不同程度的低温伤害，越夏栽培和秋延后栽培的苗期又常受到严重的高温伤害。导致辣椒生长发育受阻，产量和品质下降。近年来关于蔬菜耐热、耐寒性研究有一些报道。但多是低温或高温胁迫单一方面的研究，而且研究温度胁迫对某些生理指标的影响，很少从生理生化指标上进行选育和评价品种。另外，对高温、低温胁迫下辣椒生理生化特性的动态变化研究至今尚未见报道。高温和低温是常见的环境胁迫，更是影响农业生产的严重问题，高温、低温条件下，植物生长受到抑制，代谢导致异常，危害植株正常生长发育。141可溶性糖的影响可溶性糖是细胞内重要的渗透调节物质，在盐胁迫环境下，可调节细胞渗透势的大小，来维持水分平衡；可溶性糖含量越高，细胞适应性越强。可溶性糖是冷害条件下细胞内的保护物质，其含量与多数植物的抗寒性呈正相关。吴能表等（2003）研究证明，低温逆境处理约35MIN后，甘蓝体内可溶性糖含量达到峰值，为对照的125，之后虽有所下降，但仍远远高于对照。而在番茄上的研究表明，随处理温度的降低，可溶性糖含量逐渐增加，与品种的抗寒性呈显著或极显著正相关，且苗期和开花期一致。是因为低温诱导了水解酶的活性，使淀粉的水解加速，增加了可溶性糖的含量，提高了细胞液浓度，因而提高了抗寒性（王孝宣等，1998）。但也有的植物可溶性糖含量与其品种的抗寒性无密切关系，如甘蔗茎杆和红薯块根（刘祖祺等，1994）。刘慧英等2002的研究表明，几个参试辣椒品种在24H及48H的低温处理过程中均表现为可溶性糖含量逐渐上升，上升幅度则各异。这说明低温诱导了水解酶的活性，使淀粉的分解加速，从而增加了可溶性搪的含量，提高了细胞汁液浓度，因此也提高了这些品种的耐冷性。且试验表明，可溶性糖的含量的增加幅度越大，耐冷性越强。低温下辣椒叶片中可溶性糖的其它研究未见文献报道。7野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究142脯氨酸含量的影响脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白是植物体内的重要渗透调节物质。在逆境条件下,脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白大量积累，提高细胞液的浓度，维持细胞的膨压，降低冰点，防止原生质过度脱水。边静等、刘慧英等的研究均表明，低温处理使辣椒的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量升高。本研究结果也表明，低温处理后，辣椒叶片的脯氨酸含量、可溶性糖含量升高，逆境条件下，植物积累大量的脯氨酸，脯氨酸具有高水溶性和高水势等特点，因而在植物的低温胁迫过程中，能作为防脱水剂保护植物。同时，其作为一种重要的渗透调节物质，脯氨酸含量的增加可以有效防止低温胁迫对植物细胞膜的伤害。脯氨酸含量的高低极其变幅的大小是作物抗寒的重要生理指标之一，在胁迫的情况下脯氨酸含量越高，抗逆性越强，这一结论已经被许多研究所证实。脯氨酸能促进蛋白质的水合作用，蛋白质亲水面积增大，可溶性蛋白增多，抗性增强。本实验结果也表明，低温胁迫下，抗寒性强的品种，脯氨酸的增幅也较大，这与其所得结论是一致的。低温胁迫其含糖量都明显上升，低温胁迫叶片含糖量上升，可能是低温胁迫下，呼吸作用下降消耗减少，同时为了抵御寒冷，体内的多糖会水解使细胞质的浓度提高，这是一种生理应急反应，具体机理有待于进一步研究。BORMAN（1980）指出，脯氨酸含量增加可提高烟草的抗冷性。李建设等（2003）研究表明，经低温胁迫后游离脯氨酸含量增加，增加的幅度与品种的抗寒性强弱有关，抗寒性强的品种游离脯氨酸含量增加的多，抗寒性弱的品种则增加的少，说明耐寒性强的品种对寒害适应性强，可以积极调动内源物质来防御寒害。边静等1994以5个辣椒品种研究认为，抗冷性强的辽椒6号叶片中游离脯氨酸含量远远高于其它品种的平均值，这与温室鉴定的结果相近，因此脯氨酸含量可作为青椒抗低温的一个生理指标。陈发河等1991的研究表明，冷害低温胁迫下，甜椒果实游离脯氨酸含量和膜的透性都明显增加，这两者不仅呈显著相关，而且这些异常的代谢变化在冷害症状显现之前就早已发生。他认为这是冷害第二反应的一个方面，脯氨酸的积累是一种适应性反应。同时他还发现，变温处理可明显降低脯氨酸的积累和膜透性的增加，且可以推迟冷害症状出现的时间，其它方面未见文献报道。143可溶性蛋白质含量的影响植物对逆境反应的结果，必然会在蛋白质含量和组成上有所体现。在一定程度上表明了植物对逆境的抵抗和耐受能力，蛋白质含量增加表明有新的蛋白质合成。叶片8山东农业大学硕士学位论文中的可溶性蛋白包括各种保护酶类、RUBISCO、逆境蛋白和植物生长所需的各种蛋白，其中保护酶和逆境蛋白在逆境胁迫下占有很大比例。植物受到逆境胁迫时体内的水解酶活性增强，使一些组合蛋白分解成可溶性蛋白，但过渡胁迫会使代谢酶遭到破坏，导致可溶性蛋白含量降低，可用植物体内的蛋白质含量或降解速率作为抗逆选择的依据。144保护酶（SOD，POD，CAT）在温度逆境胁迫中的影响过氧化物酶（POD）是植物逆境胁迫或衰老过程中细胞自由基的酶促防御体系中重要的保护酶之一（陈少裕等，1991）。POD是植物体内担负清除H2O2的主要酶类之一，POD能催化H2O2分解成H2O和O2。一般认为，POD活性升高是植物抗性的表现形式（SMITEHC,1987）杨广东研究发现，8和12处理温度下，POD活性变化在不同抗冷性青椒品种间差异显著，且POD活性与品种抗冷性呈显著或极显著的正相关性。邹志荣认为，随处理温度降低，辣椒POD活性增高，同时随着低温持续时间延长，POD活性也呈增加趋势。研究对不同基因型辣椒始花期进行低温处理，试图探明辣椒叶片中POD同工酶谱带和可溶性蛋白谱带的变化，以及低温对辣椒叶片POD同工酶和可溶性蛋白谱带的影响，为辣椒耐低温栽培和育种提供理论依据。过氧化物酶是植物抗逆反应过程中的关键酶之一，是普遍存在于植物组织中的一种氧化还原酶。POD以H202作为电子受体，氧化各种次生代谢过程中的物质。不同外界条件均可诱导POD活性及其同工酶发生变化，已被广泛用于植物的抗逆性研究中。POD也是木质素形成过程中的关键酶类。木质素含量及其相关酶系活性与植物的生长发育、抗病性、抗逆性密切相关（侯仲娥等，2000）。在对杨树光肩星天牛的研究中测得毛白杨POD增长率最大（17），由此认为POD与抗逆性有一定的关系。超氧化物歧化酶SOD在生物体内，氧被视为电子传递的受体，得到电子时能生成超氧化物阴离子及其衍生物H2O2、OH、O2等自由基（BOWLERCETAL，2003；张福锁，2007）。正常状态下，生物细胞代谢产生的活性氧并不对生物体造成严重危害。在逆境条件下，可对其造成危害。而SOD能有效抑制活性氧自由基对机体的伤害，催化超氧自由基产生歧化反应，生成毒性较小的H2O2和O2。而H2O2又能在CAT、POD等的作用下转化成H2O与O2，维持活性氧代谢的平衡，保护膜结构，在一定程度上减缓或抵御逆境胁迫（MCCORD等，1969；ALSCHER等，2002；CHAITANYA等，2002）。张9野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究金锋等2004）认为植物受害虫危害胁迫后SOD活性迅速上升，从而有效的抑制活性氧自由基的产生，提高植物抗逆能力。SOD是植物体内清除自由基的最关键酶之一。过氧化氢酶CAT过氧化氢酶存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的OH。对于CAT的研究，植物病理学方面研究较多，但不同学者得出了不同的结论，目前支持率最高的是作为水杨酸结合蛋白（SALICYLICACIDBINDINGPROTEIN，SABP）的解释（CHENZETAL，1991）。CAT主要存在于植物的过氧化物体（或乙醛酸循环体）中，主要功能是清除光呼吸或脂肪酸氧化过程中形成的H2O2，CAT活力的升高有助于清除细胞中代谢所产生的H2O2（曹军等，2004；汪炳良等，2004）。POD、CAT与SOD一样，都是植物体内清除活性氧的重要酶类，对细胞的抗氧化、衰老具有重要意义，其活性的高低标志着植物细胞自身抗衰老能力的强弱（魏道智等，2004）。多数植物在受到逆境胁迫时，其活性增强，以加速活性氧等自由基的清除，维持植物体的正常生理活动（LIDONFC，2000；汪炳良等，2004）。145MDA含量的影响MDA是植物在遭受逆境伤害时发生膜脂过氧化作用的产物，在叶片衰老过程中不断积累，通常可以用MDA的含量衡量细胞膜的氧化程度和植物对逆境反应的强弱（朱其杰，1995；CORBINEAUF，2002）。它的含量变化常用来表示膜脂过氧化程度及膜结构的损伤程度，所以MDA是判断细胞遭受胁迫程度大小的一个较好的指标。刘裕强等（2005）认为植物在受到温度危害或机械损伤后，体内活性氧代谢系统的平衡受到影响，体内膜脂过氧化和膜脂脱氧化作用被启动而破坏膜结构。丙二醛（MALONDIALDEHYDE，MDA）是植物细胞膜脂过氧化的一个重要指标（BAILLYCETAL,1996），能与细胞内各种成分发生反应，从而导致蛋白质、核酸、多糖和膜脂分子的氧化破坏（蒋明义等，1993）。随之寄主体内也将发生一系列的防御反应，包括植物组织的坏死反应、植物本身营养成份质和量方面的改变、分泌毒性化合物、产生引诱天敌昆虫的化学物质等，从而使植物产生有利于植物本身的变化，避免或减轻受害（康乐等，2004）。而酶恰恰是这些特性表现的基础。其中，超氧化物歧化酶（SUPEROXIDEDISMUTASE，SOD）、过氧化物酶（PEROXIDASE，POD）、过氧化氢酶（CATALASE，CAT）、多酚氧化酶（POLYPHENOLOXIDASE，PPO）及苯丙氨酸解氨酶10山东农业大学硕士学位论文（PHENYLALANINEAMMONIALYASE，PAL）都在植物的抗逆防御过程中起着重要的保护作用（刘裕强等，2005；陈青等，2004；张金锋等，2004）。丙二醛是植物细胞膜脂过氧化的一个重要指标（BAILLYC，1996，能与细胞内各种成分发生反应，从而引起各种酶和膜结构的严重损伤。MDA含量和细胞膜透性是较好地反映植物抗逆能力的指标。前人研究结果表明，上述指标的变化在种间及不同处理条件下存在着差异，如周艳红等的研究表明，无论在12弱光,还是在7弱光下，黄瓜幼苗叶片中MDA含量增加。15辣椒耐热性研究现状近年来，随着设施蔬菜在我国的迅速发展，辣椒以其营养价值高、经济效益好而在设施蔬菜种植中占有很大的比例。在设施栽培中，辣椒生长发育适宜的温度范围为白天2027，夜间1518，超过35则生长发育受阻，发生落叶、落花现象，结果能力随之下降，产量锐减。而设施内气温有时则高达40以上，因此，从生物学产量、生化指标等方面研究高温胁迫对辣椒幼苗生长发育的影响，对指导辣椒生产具有现实意义。为选育耐热辣椒品种和研究高温条件下辣椒优质丰产栽培技术，一些研究者相继开展了高温胁迫下辣椒细胞学、生理生化等方面的研究。周人纲等和张宗申等报道了高温胁迫对辣椒细胞膜的伤害。姚元干等报道了高温胁迫下辣椒抗氧化系统的变化。而关于高温胁迫下不同辣椒品种生理生化方面的研究鲜有报道。是一种喜温性植物，而高温却不利于其生长。高温往往造成其结果能力下降，产量降低。但是这方面的研究主要集中在高温对生殖生长方面的影响，而对其苗期生理生化变化研究较少。光合作用是植物有机物质的主要来源，高温下保持高的光合作用是辣椒获得高产的基础。加强这方面的研究，有望获得在高温下保持高产的途径或方法。本文拟研究高温对辣椒幼苗生理生化指标的变化影响，为选育耐高温辣椒品种和耐高温栽培提供理论依据。16辣椒抗寒性研究现状低温冷害是设施栽培中限制作物产量和品质的重要因素，筛选、培育耐低温冷害品种已成为国内外的育种目标。耐低温冷害性鉴定是研究植物耐性机理和筛选耐低温冷害材料的基础，而所采用鉴定指标的合理性及准确性是对育种材料耐性进行客观评价的关键。辣椒原产中南美洲热带地区，是人们广为喜爱的喜温蔬菜，亦是冬、春设11野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究施栽培的主要作物，但冬、春季温室的低温弱光抑制其生长发育，致使其产量和品质降低，制约着设施辣椒冬春季节生产效益的提高和栽培面积的扩大。目前，尚无辣椒耐低温冷害种质鉴定筛选的统一指标和方法。植物体内游离脯氨酸PRO、可溶性糖、可溶性蛋白作为胞质渗压剂、酶和细胞结构的保护剂，可对低温逆境下的植物起保护作用。有关低温冷害下辣椒PRO、可溶性糖、可溶性蛋白含量的变化已有报道，但有关低温冷害下丙二醛、主要保护酶SOD、POD、CAT的报道还较少。17本课题研究的目的和意义当前，对辣椒的研究主要集中在新品种选育、抗病抗虫研究、设施栽培、辣椒红素、辣椒素及提取物抗氧化方面。本实验中所应用的野生辣椒小米辣是引种于云南的野生品种，在长期的自然恶劣环境选择的压力，逐步演化出了耐高温潮湿的特点，抗病性也随之增强。土壤选择的压力又使得小米辣养成了耐瘠薄的特点，长期生长于树荫下还使得小米辣具有了耐低温弱光的特性。此外，小米辣的单株坐果率也很高。应加大利用辣椒属种间杂交创制新种质材料的研究力度。将国内野生种质资源应用到辣椒育种工作中。因此，该研究具有理论和实践等方面的意义，主要在于1对野生种和栽培种进行正确、有效的比较及评价，为更好地开发、利用野生辣椒这一资源具有重要的指导意义。2深入研究我国特有的野生辣椒小米辣的生长发育特点，以及温度逆境胁迫下的生理生化指标的影响有着重要的理论意义和实践意义。3对于野生辣椒抗逆性生理生化指标的分析将为辣椒的抗性育种提供理论和试验依据。4通过比较野生辣椒和栽培种辣椒的抗逆性差别，选育和种植抗逆性比较强的辣椒品种，不仅对蔬菜产业开发和生态环境建设具有重要意义，而且减少了对设施栽培的需求，降低了生产成本。12山东农业大学硕士学位论文2材料与方法21材料试验以野生辣椒小米辣与不同果型普通辣椒代表性品种（灯笼椒，大牛角椒，朝天椒）为材料，种子由山东农业大学园艺科学与工程学院辣椒课题组提供。1野生辣椒小米辣（M）引种自云南省的野生辣椒资源小米辣，其花冠绿白色花期长，每节位处着生2朵花或更多，开花期花梗直立，小米辣耐低温弱光，耐热性好，耐病虫害，长势很强，连续坐果率高，唯一不足是受茶黄螨危害严重。2灯笼椒（431）属于甜柿椒类又称柿子椒、甜椒或灯笼椒。植株中等，分枝性弱。叶片较大，椭圆形。果实硕大扁圆形。果面常具34条纵沟。果肉肥厚，结果数较少。耐热与抗病性不及辣味品种。冷凉地区栽培比炎热地区的产量高。3牛角椒（419）为圆锤椒类，株型中等，叶片中等大小，卵圆，果实呈圆锤形，果梗下垂，果肉较厚，辣味中等。4朝天椒（HZ）属簇生椒，株型较高，分枝性不强，叶片较长大，果实簇生。每簇35个。果梗朝天，果色深红、果肉薄、辛辣味强、油分高、晚熟、耐热，主要供干制调味。22试验处理试验于2009年9月催芽后在山东农业大学实验温室内播种育苗，育苗基质为体积各占1/3的园土、有机肥和蔬菜专用育苗基质，育苗期间按常规管理。待辣椒幼苗长至五叶一心时放入人工气候箱中进行处理,光照均为1500MOL/M2S左右，光照时间为12H，采用人工控制环境的方法培养。221不同胁迫温度的处理对照处理（CK）昼/夜温度分别为27/18。高温处理40/30（昼/夜温度）为T1，37/26（昼/夜温度）为T2，30/22（昼/夜温度）为T3；低温处理5/0（昼/夜温度）为T4，10/5（昼/夜温度）为T5，15/10（昼/夜温度）为T6。13野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究222苗期高温胁迫处理以野生辣椒小米辣M和3个不同果型普通辣椒代表性品种（431，419，HZ）为材料，常温对照处理（CK）人工气候箱昼/夜温度分别为27/18。高温处理昼/夜温度分别为30/25提前预处理1天，然后调至昼/夜温度分别为37/26，每处理50株，选取长势一致的健壮幼苗15株进行试验，重复3次，分别于第1天，第4天，第7天，第10天取样进行相关指标的测定。223苗期低温胁迫处理以野生辣椒小米辣M和3个不同果型普通辣椒代表性品种（431，419，HZ）为材料，常温对照处理（CK）人工气候箱昼/夜温度分别为27/18。低温处理昼/夜温度分别为15/10提前预处理1天，然后调至昼/夜温度分别为10/5，每处理50株，选取长势一致的健壮幼苗15株进行试验，重复3次，分别于第1天，第4天，第7天，第10天取样测定。224杂交一代种与亲本苗期温度胁迫处理以野生辣椒小米辣M和3个不同果型普通辣椒代表性品种（431，419，HZ）为材料，蕾期采用人工蕾期去雄的方法授粉，收取一代杂交种。采用人工控制环境的方法，正常温度分别为27/18（昼/夜温度）处理为对照（CK）。温度胁迫处理高温处理昼/夜温度分别为30/25提前预处理1天，然后调至昼/夜温度分别为37/26；低温处理昼/夜温度分别为15/10提前预处理1天，然后调至昼/夜温度分别为10/5，每处理50株，选取长势一致的健壮幼苗15株进行试验，重复3次，分别于第1天，第4天，第7天，第10天取样进行相关指标的测定。23测定项目及方法231仪器设备1GXZ500C型培养箱容积500L，控温范围050，光照度22000LX，温度波动度1，加热功率400W。2紫外分光光度计UV2450波长范围190900NM，分辨率01NM，普带宽度015NM，6段转换，杂散光0015以下，双光束方式，检测器光电倍增管。14山东农业大学硕士学位论文3台式高速冷冻离心机美国赛默飞世尔（THERMOFISHER）型号HERAEUSMULIFUGEX1R。232生态指标的测定各品种取20株进行不同温度（CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6）胁迫处理10天，重复三次。测定株高、茎粗、叶片数、落叶数、死亡率。同时对温度胁迫处理后外部形态进行观察。株高使用直尺测量，茎粗使用游标卡尺测量。死亡率死亡植株数/植株总数100233热害指数测定各品种取50株进行高温处理白天20夜晚30提前预处理1天，后24小时全天38高温处理3天，根据受害级别计算冷害指数。0级，生长正常，为受伤害。1级，仅少数叶片边缘有轻度的褶皱萎缩。2级，半数以下的叶片萎焉死亡。3级，半数以上的叶片萎焉死亡。4级，植株全部死亡。热害指数（1S12S23S34S4）/高温胁迫总株数4注S1是一级热害植株株数；S2是二级热害植株株数；S3是三级热害植株株数；S4是四级热害植株株数。234冷害指数测定各品种取50株进行低温处理白天10夜晚5提前预处理1天，后24小时全天2低温处理3天，根据受害级别计算冷害指数。0级，生长正常，为受伤害。1级，仅少数叶片边缘有轻度的褶皱萎缩。2级，半数以下的叶片萎焉死亡。3级，半数以上的叶片萎焉死亡。4级，植株全部死亡（王孝宣，1996）。冷害指数（1S12S23S34S4）/低温胁迫总株数4注S1是一级冷害植株株数；S2是二级冷害植株株数；S3是三级冷害植株株数；S4是四级冷害植株株数。235可溶性糖含量测定可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法（赵世杰等，1994）。03G鲜样加10ML蒸馏水，封口沸水浴30MIN（2次），滤纸漏斗过滤入50ML容量瓶中，冲洗残渣，定容。吸提取液1ML，加蒸馏水1ML（对照加2ML蒸馏水），加蒽酮乙酸乙酯液05ML，加浓H2SO45ML，振荡，沸水浴1MIN，自然冷却，于630NM下比色（邹奇，2001）。15野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究236脯氨酸含量测定脯氨酸PRO含量测定酸性茚三酮法。采用05G鲜样（或005G干样），加5ML磺基水杨酸，封口沸水浴10MIN，冷却，用滤纸漏斗过滤，吸滤液2ML（对照吸蒸馏水2ML），加2ML冰乙酸，再加3ML酸性水合茚三酮显色液，沸水浴40MIN，冷却，加5ML甲苯，充分震荡，静置分层，取上层甲苯液于520NM下比色（赵世杰等，1998）。237可溶性蛋白含量测定可溶性蛋白采用考马斯亮兰G250染色法。G250100MG溶于50ML，90的乙醇中，加入85（W/V）磷酸100ML，定容至1000ML。取上述上清液40L（对照加40L水），加3ML考马斯亮兰，放置2MIN后，马上于595NM下比色（邹奇，2001）。238保护酶（SOD，POD，CAT）活性含量测定酶液的提取称05G鲜样，加1ML磷酸缓冲液（005MOL/L，PH78），冰浴研磨，研磨后再加1ML缓冲液，倒入离心管中，再用2ML缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（04）离心20MIN（10500RPM），离心后上清夜即为酶液，冷藏保存。超氧化酶岐化酶（SOD）活性测定用NBT还原GINNOPOLITIS,1977取型号相同的试管，试管中加50L上清液2支对照试管中各加磷酸缓冲液50L，分别加3ML反应液，其中1支对照试管置于暗处，其余各管于4000LX日光下反应2030MIN（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。反应结束后，以不照光的对照管作空白，于560NM下比色测定吸光度值。过氧化物酶POD活性测定采用愈创木酚氧化比色法测定。反应液01MOL/L，PH60的磷缓50ML，加入愈创木酚28L，于磁力搅拌器上加热溶解，加入30H2O219L存于冰箱中。取上清液40L加入比色杯中（对照加40L磷缓），加3ML反应液，马上读470NM下的OD值并计时，每隔30秒读一次（读0、30、60、90秒的OD值）。16山东农业大学硕士学位论文过氧化氢酶（CAT）活性测定采用过氧化氢比色法测定赵世杰等,1998取上清液100L加入比色杯中（对照加100L磷缓），加3ML反应液，马上读240NM下的OD值并计时，每隔30S读一次（读0、30、60、90S的OD值）（赵世杰等，1998）。239丙二醛（MDA）含量测定丙二醛（MDA）含量测定采用巴比妥酸法（TBA法）（赵世杰等，1999）067TBA称067GTBA，加少量1MOL/LNAOH溶液，再用10三氯乙酸定容至100ML。取上述上清液1ML（对照加1ML水），加3ML067TBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15MIN，迅速冷却（用冷水冲泡），倒入指形管中，10000RPM下离心5MIN，取上清液于600NM、532NM、450NM下比色。17野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究3结果与分析31处理温度的确定311高温胁迫温度由表1可知，高温处理T1（40/30昼/夜温度）为重度胁迫温度，处理10天后，不能保证植株的正常生长，出现叶片脱落现象严重。T2（37/26昼/夜温度）为中度胁迫温度，是最合适胁迫温度，T3（30/22昼/夜温度）为轻度胁迫温度与对照CK（27/18昼/夜温度）差异不大。表1苗期不同高温处理各材料生态指标TAB1HIGHTEMPERATURETOHANDLEALLTHEMATERIALSATSEEDLINGSTAGEDIFFERENTECOLOGICALINDEX灯笼形（431）LANTERNFORM431大牛角形（419）BIGHORNTYPE419野生辣椒（M）WILDCHILIM朝天椒（HZ）CHAOTIANJIAOHZT1T2T3CKT1T2T3CKT1T2T3CKT1T2T3CK株高（CM）PLANTHEIGHTCM234A202A175B174B187C169C155B149A141A121B104B96B243A221B197C191C茎粗（CM）STEMDIAMETERCM028C034D035B038A029B033C036B037A021D022C022B024A027AB032B035A035A叶片数（片）LEAFNUMBERPIECE77A72B67C63C81A74B66C65C118A116B107C106C86A79B68D71C落叶数（片）DECIDUOUSNUMBER23010016010018000340200PIECE死亡率（）1400015000110000000MORTALITY注各列A,B,C,D小写字母表示差异显著性（P005）。NOTEEACHCOLUMNA,B,C,DSMALLLETTERSMEANSIGNIFICANTDIFFERENCEP005312低温胁迫温度由表2可知，低温处理T4（5/0昼/夜温度）为重度胁迫温度，处理10天后，植株的不能正常生长，出现植株死亡现象。T5（10/5昼/夜温度）为中度胁迫温度，是最合适胁迫温度，T6（15/10昼/夜温度）为轻度胁迫与对照CK（27/18昼/夜温度）差异不大。18山东农业大学硕士学位论文表2苗期不同低温处理各材料生态指标TAB2LOWTEMPERATURETOHANDLEALLTHEMATERIALSATSEEDLINGSTAGEDIFFERENTECOLOGICALINDEX灯笼形（431）LANTERNFORM431大牛角形（419）BIGHORNTYPE419野生辣椒（M）WILDCHILIM朝天椒（HZ）CHAOTIANJIAOHZT4T5T6CKT4T5T6CKT4T5T6CKT4T5T6CK株高（CM）84D152C161B174A87D119C133B149A61D75C84B96A163C221A197B191BPLANTHEIGHTCM茎粗（CM）STEM021C031B035A038A029C033B036A037A021B022B022AB024A027C032B035A035ADIAMETERCM叶片数（片）LEAF51D72A67B63C61C74A66B65B118A116AB107C106BC86A79B68C71CNUMBERPIECE落叶数（片）DECIDUOUSNUMBER36010027010017000310200PIECE死亡率（）MORTALITY32000210001300019000注各列A,B,C,D小写字母表示差异显著性（P005）。NOTEEACHCOLUMNA,B,C,DSMALLLETTERSMEANSIGNIFICANTDIFFERENCEP00532高温胁迫对辣椒幼苗的影响321辣椒幼苗热害指数热害指数可作为鉴定辣椒幼苗耐热性强弱的灵敏指标，热害指数越小受害越轻，从而说明其耐热性越好，由表3可看出野生辣椒小米辣M热害指数为031数值最小，说明野生辣椒M的受热害最轻，灯笼形辣椒（431）和朝天椒（HZ）的热害指数比较接近，高于野生小米辣的热害指数，低于大牛角形辣椒（419）的热害指数，受高温危害程度居中，大牛角形辣椒（419）的热害指数最大为079，说明其受高温危害最严重。耐热性强弱程度小米辣朝天椒灯笼椒大牛角椒表3高温处理辣椒幼苗热害指数比较TAB3HIGHTEMPERATURETREATMENTCHILISEEDLINGHEATPOLLUTIONINDEXCOMPARISON材料MATERIALS灯笼形（431）处理温度（）PROCESSINGTEMPERATURE38处理天数（D）PROCESSINGDAYSD3热害指数THERMALPOLLUTIONINDEX059差异显著性005DIFFERENCESSIGNIFICANT005B差异显著性001DIFFERENCESSIGNIFICANT001BLANTERNFORM431大牛角形（419）383079AABIGHORNTYPE419野生辣椒（M）WILDCHILIM朝天椒（HZ）383833031056DCCBCHAOTIANJIAOHZ19可溶性糖含量（）SOLUBLESUGARCONTENT（）可溶性糖含量（）SOLUBLESUGARCONTENT（）可溶性糖含量（）SOLUBLESUGARCONTENT（）野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究322高温处理对辣椒幼苗可溶性糖的影响植物在受到逆境伤害的时候，自身会产生一些渗透调节物质来适应逆境，这些物质含量高低与快慢均可反映植物本身对逆境的适应能力。由图1可知，高温胁迫时辣椒各材料可溶性糖含量随处理时间的延长逐渐增高的趋势，最后达到最高点，且可溶性糖含量均低于对照CK。M可溶性糖含量高于431（图1上），M可溶性糖含量第1天时高于419后逐渐下降但第10天时仍保持较高的水平（图1中），HZ同431可溶性糖含量变化趋势相同（图1下）。CKMMCK43143100012000100008000060000400002014710处理天数DPROCESSINGDAYSDCKMMCK41941900012000100008000060000400002014710处理天数DPROCESSINGDAYSDCKMMCKHZHZ00012000100008000060000400002014710处理天数DPROCESSINGDAYSD图1高温处理对辣椒幼苗可溶性糖含量的变化FIG1HIGHTEMPERATURETREATMENTTOCAPSAICINSEEDLINGSOLUBLESUGARCHANGES20脯氨酸含量G/GPROLINECONTENTG/G脯氨酸含量G/GPROLINECONTENTG/G脯氨酸含量G/GPROLINECONTENTG/G山东农业大学硕士学位论文323高温处理对辣椒幼苗脯氨酸的影响脯氨酸在植物耐热中发挥着重要的作用，由图2可知，高温处理阶段脯氨酸含量第1天达到最大值，后呈现逐渐降低的趋势。M、419、HZ脯氨酸含量高于对照CK，在第1天达到最大脯氨酸含量。M脯氨酸含量明显高于431、419（图2上，中），M脯氨酸含量和HZ较为接近（图2下）。CKMMCK43143112108060402014710处理天数DPROCESSINGDAYSDCKMMCK41941912108060402014710处理天数DPROCESSINGDAYSDCKMMCKHZHZ12108060402014710处理天数DPROCESSINGDAYSD图2高温处理对辣椒幼苗脯氨酸含量的变化FIG2HIGHTEMPERATURETREATMENTTOCAPSAICINSEEDLINGPROLINECONTENTCHANGES21可溶性蛋白含量MG/GSOLUBLEPROTEINCONTENTMG/G可溶性蛋白含量MG/GSOLUBLEPROTEINCONTENTMG/G可溶性蛋白含量MG/GSOLUBLEPROTEINCONTENTMG/G野生辣椒和普通辣椒耐热耐冷性研究324高温处理对辣椒幼苗可溶性蛋白的影响植物对逆境反应的结果，必然会在蛋白质含量上有所体现。由图3可知，高温胁迫处理对可溶性蛋白的含量水平带来了一定的影响，可溶性蛋白含量总的变化趋势是先升高后降低又升高，然后又出现降低的趋势，各处理材料表现出相似的规律，显著高于对照CK。M可溶性蛋白质含量明显高与431、419（图3上，中），M可溶性蛋白质含量与HZ接近，在第4天、第10天高于HZ（图3下）CKMMCK431431090807060504030201014710处理天数DPROCESSINGDAYSDCKMMCK419419090807060504030201014710处理天数DPROCESSINGDAYSDCKMMCKHZHZ12108060402014710处理天数DPROCESSINGDAYSD图3高温处理对辣椒幼苗可溶性蛋白含量的变化FIG3HIGHTEMPERATURETREATMENTTOCAPSAICINSEEDLINGSOLUBLEPROTEINCONTENTCHANGES22SOD含量UNITSMG1SODCONTENTUNITSMG1SOD含量UNITSMG1SODCONTENTUNITSMG1SOD含量UNITSMG1SODCONTENTUNITSMG1山东农业大学硕士学位论文325高温处理对辣椒幼苗SOD的影响较高的SOD活性是植物抵抗逆境胁迫的生理基础之一。图4表明，高温胁迫处理下，SOD活性总的变化趋势是先升高然后又降低，M第1天有较高的SOD水平，大灯笼椒431高温处理后SOD活性保持上升的趋势（图4上），M的SOD活性第1天、第4天高于419（图4中），M的SOD活性和HZ接近，但第10天高于HZ（图4下）。CKMMCK4314318070605040302010014710处理天数DPROCESSINGDAYSDCKMMCK4194198070605040302010014710处理天数DPROCESSINGDAYSDCKMMCKHZHZ8070605040302010014710处理天数D