耳叶苔毕业设计论文

摘要PSBA基因编码的D1蛋白是光系统（PS）的重要组成部分，参与维持PS反应中心构象的稳定和电子的传递。以耳叶苔科植物的PSBA基因序列作为研究材料，通过预测耳叶苔科各物种间的分化时间，推测可能影响其进化的外部因素；应用位点模型、分支模型、分支位点模型以及FEL模型对PSBA基因进行适应性进化分析，检测可能受到正选择的位点，为D1蛋白的结构和功能研究提供参考信息。研究结果显示耳叶苔科植物最早的分化发生在距今约121MA年前，进入新生代分化速度明显加快，推测与被子植物的兴盛有关；通过适应性进化分析，在D1蛋白中检测到4个正选择位点，30个高度保守的位点，研究结果再一次验证了PSBA基因高度保守的特性。关键词耳叶苔科；PSBA基因；分歧时间；适应性进化；DIVERGENCETIMEESTIMATIONANDADAPTIVEEVOLUTIONANALYSISOFFRULLANIACEAE1ABSTRACTD1PROTEINENCODEDBYPSBAGENEISANVERYIMPORTANTCOMPONENTOFPHOTOSYNTHESISSYSTEMPSANDCONTRIBUTESTOTHESTABILITYOFPSSREACTIONCENTERANDELECTRONTRANSFERTHEDIVERGENCETIMEISESTIMATEDUSINGPSBAGENEOFFRULLANIACEAE,THEADAPTIVEEVOLUTIONOFPSBAGENEISALSOANALYZEDUNDERSITEMODEL,BRANCHMODEL,BRANCHSITEMODELANDFELMODEL,RESPECTIVELYTHERESULTSHOWSTHATTHEFIRSTDIVERGENCEEVENTHAPPENEDABOUT121MAAGO,THESPEEDOFDIVERGENCEACCELERATEDAFTERCENOZOICFOURSITESWEREFOUNDEDUNDERPOSITIVESELECTIONWHILETHIRTYSITESUNDERNEGATIVESELECTIONANDNOSITEWASFOUNDEDTOEXPERIENCEDCOEVOLUTIONTHERESULTOFOURRESEARCHISANOTHEREVIDENCEOFTHEHIGHLYCONSERVATIVEOFPSBAGENEKEYWORDSFRULLANIACEAEPSBAGENEDIVERGENCETIMEADAPTIVEEVOLUTIONCOEVOLUTION收稿日期修改稿收到日期基金项目作者简介孙君波1986，男（汉族），硕士生，专业方向植物学。EMAILDXXSJB163COM通讯作者苏应娟1965，女，博士，研究方向进化遗传学。TEL02084111939EMAILSUYJMAILSYSUEDUCN在相当长的一段时间里，人们普遍认同这样一种观点白垩纪被子植物的兴起伴随着包括蕨类植物在内的众多非种子维管植物多样性和丰富度的急剧下降。SCHNELDER等基于化石记录利用分子钟重新估算了被子植物和蕨类各自的分化时间，研究结果表明现存的绝大多数蕨类植物的分化发生在白垩纪被子植物繁盛之后，即蕨类在适应由被子植物提供的新的生境的过程中发生了物种的“辐射式”增长。之后对水龙骨科附生蕨类RBCL基因的适应性进化分析表明蕨类植物的确可以通过功能基因的进化达到适应外界新环境的目的。苔藓植物是一类与蕨类具有相似起源与进化历史的植物类群，对蕨类的研究结果提示我们苔藓植物在进化过程中极有可能也经历了类似的物种快速分化的阶段。耳叶苔科（FRULLANIACEAE）是苔类植物中较大的一科，包括毛耳苔属（JUBULA）和耳叶苔属（FRULLANIA）。现存的耳叶苔科植物约有800多种12，主要分布于热带、亚热带地区，其生活方式以附生为主。由于在水分、光照等方面存在较大差异，推测耳叶苔科各物种在进化过程中相关的功能基因会发生适应性进化，尤其是与光合作用相关的基因。光系统（PS）定位于叶绿体的基粒类囊体膜上，是光反应“Z”链上的第一个蛋白色素复合体，同时也是自然界中唯一一个能将水分子分解成氢和分子氧的复合体。PS主要负责光能的吸收、传递和转化，在光合作用过程中发挥重要作用。PSBA基因编码的D1蛋白是构成PS反应中心的核心蛋白之一，与D2蛋白共同构成了PS的基本骨架；D1蛋白也是PS中一个重要的功能蛋白亚基，直接能与了光合作用过程中原初电荷的分离与电子传递，因此，D1蛋白在结构上发生的任何改变都有可能极大的影响PS的结构与功能，进而影响光合作用的效率。因此在时间框架下对PSBA基因进行适应性进化分析将有助于进一步阐明光合作用中功能基因适应性进化的机制。生物进化就是生物与环境之间相互作用并导致遗传系统与表型发生一系列不可逆改变并不断适应环境的过程（杨继等植物生理学，高等教育出版社）。在分子水平上进行适应性进化分析可以为蛋白的结构和功能研究提供重要的参考信息。尤其是1962年ZUCKERKANDL提出分子钟假说之后，人们可以在时间框架下研究生物的进化历史，并将生物的进化与地质史上的重大事件联系起来，有助于深入理解环境变迁影响生物适应性进化的机制。经过近五十年的发展与完善，如今的“分子钟”假说已经较好的解决了不同谱系间分子异速进化的问题，即使在缺少化石资料的情况下也可以很好的估计物种的分歧时间，这为研究早期物种的适应性进化提供了契机。鉴于PSBA基因在光合作用中的重要作用以及GENBANK中已经收录了大量的PSBA基因全序列，本研究选取110种耳叶苔科植物的PSBA基因全序列进行适应性进化分析，目的在于（1）通过估计耳叶苔科各物种的分化时间，推测可能影响其进化的地质事件；（2）检测PSBA基因各位点在进化过程中承受的选择压力，进而推断在维持D1蛋白结构、功能以及适应环境方面发挥重要作用的位点，为D1蛋白的结构功能研究提供参考资料。1、材料和方法11序列数据从GENBANK下载110种耳叶苔科植物以及6种作为外类群的细鳞苔科植物的PSBA基因全长序列表1。应用CLUSTALX20软件9对序列进行多重比对并加以手工校正；编辑后的序列矩阵中，每条序列包含有1059个核苷酸，353个密码子。本文中氨基酸位点编号参照LEJEUNEAPALLESCENS（ABL86495）的编码。12耳叶苔科系统发育重建与分歧时间估计运行MODELTEST37软件选取最优的核苷酸进化模型。根据MODELTEST选取的GTRIG模型设置似然模型参数，用MRBAYES312软件经贝叶斯途径构建系统发育树。系统发育模型的后验概率依据MROPOLISHASTINGSGREEN算法通过4条链（MARKOVCHAINMONTECARLO,MCMC）运行15000000代估计。MCMC分析以随机树起始，每100代保存1棵树，使用TRACERV141软件12检验各参数的收敛程度。最初的37500棵树被当作老化样本摒弃，以剩余样本构建系统发育树。采用BEASTV153软件10中的UCLD（UNCORRELATEDLOGNORMALDISTRIBUTEDRELAXEDCLOCKMODEL）分子钟模型估算各分支的分歧时间，利用最近共同祖先时间（TMRCA，THEMOSTCOMMONANCIENT）对各分支的分歧时间加以校正。根据MODELTEST37软件11选取的核苷酸替换模型设定MCMC运算的参数，迭代运算30000000代，每1000代保存1株样本；利用TRACERV141软件12检验各参数的收敛程度。将最初的7500棵树作为老化样本摒弃，用剩余样本重建时间尺度下的一致树。表1植物材料及其PSBA基因GENBANK登录号TABLE1PLANTMATERIALSANDTHEIRPSBAGENEGENBANKACCESSIONNUMBERS中文名CHINESENAME学名SPECIESNAMEGENEBANK登录号ACCESSIONNUMBERFRULLANOIDESMEXICANASLAGERENEF011851FRULLANIAACULEATATAYLORFJ380698喙尖耳叶苔FRULLANIAACUTILOBAMITTFJ380572FRULLANIAAFFNEUROTACOSTABTHEDNANDDSVALUESOF30HIGHLYCONSERVEDSITES24正负选择位点的定位由SWISSMODEL预测得到D1蛋白第10到344号位点的三维结构，用RASWIN软件将检测到的正选择位点和高度保守位点在三维结构上进行定位。正选择位点155T和203I分别定位在跨膜螺旋B和D上图4，另两个正选择位点345A和351V位于C末端的九个氨基酸残基的延长区（该区域在成熟的D1蛋白中被切除）。将FEL模型检测到的30个高度保守的位点在D1蛋白的三维结构上进行定位发现，这些位点大多在维持D1蛋白的结构稳定和电子的传递方面扮演重要的角色。有11个位点（33F、115I、130E、132E、133L、162P、163I、205V、270S、271L、286T）定位在跨膜螺旋上（图5），由此可见这些跨膜螺旋对于维持D1蛋白结构和功能非常重要；另有8个位点（77I、130E、228T、252H、263A、270S、271L、323R）是D1蛋白与D2蛋白间发生相互作用的位点；另有两个位点（252H、271L）还参与了QB结合“口袋”的形成，而QB在D1蛋白上的结合位点正是多种有机农药的作用位点，这些位点的突变与植物各种抗性特征的形成有关33。其他的位点参与了D1蛋白膜两侧结构域的形成，可能在维持D1蛋白结构和电子的快速传递方面发挥作用。图4PSBA基因编码D1蛋白三维结构以及正选择位点的空间位置（基质侧在上，类囊体腔侧在下）FIGURE4THE3DSTRUCTUREOFD1PROTEINENCODEDBYPSBAGENEANDTHEPOSITIONFORTHEPOSITIVELYSELECTEDSITESTHECYTOPLASMICSIDEISONTOP,THELUMENALSIDEONTHEBOTTOM图5PSBA基因编码D1蛋白比对结果用红色阴影标出部分表示五处跨膜结构域，分别用H1、H2、H3、H4、H5表示。FIGURE5THEALIGNMENTRESULTFORD1PROTEINENCODEDBYPSBAGENEFIVETRANSMEMBRANEREGIONSAREHIGHLIGHTED,SIGNEDBYH1、H2、H3、H4、H5,RESPECTIVELY3讨论本研究利用已报道的耳叶苔科与细鳞苔科的分歧时间（1559103百万年前）进行单点校正，估计得耳叶苔科PSBA基因第一次分化事件，即毛耳苔属和耳叶苔属的分化，发生在距今约121百万年的白垩纪。进入新生代（约650百万年前）之后分化速度明显加快，尤其是渐新世中期（距今约300百万年），耳叶苔科的丰富度呈现出“辐射性”增长的趋势。这促使我们不得不思考这样一个问题促使耳叶苔科发生这种物种“辐射式”增长的动力是什么呢SCHNEIDER29等的研究认为，在白垩纪被子植物的繁盛导致陆地生态系统发生显著变化。为应对被子植物引起的陆地生态系统的变化，蕨类植物在白垩纪发生物种的“辐射式”分化。苏应娟等对水龙骨科附生蕨类RUBISCO大亚基的研究也验证了这一点。由此我们可以推测，白垩纪被子植物兴起后也改变了耳叶苔科植物生存的环境，再加上高达的被子植物本身也为附生其上的耳叶苔植物提供了复杂的生存环境（树干的不同部位光照强度和水分条件存在显著差异），这极有可能导致耳叶苔科植物经历与蕨类植物相似的物种进化过程。另外，耳叶苔科植物物种的“辐射式”增长与当时地球的气候变化关系密切。进入新生代之后，地球上曾发生许多重大的地质事件26，比如古新世始新世最热事件PETM，PALEOCENEEOCENETHERMALMAXIMUM、渐新世初大冰期事件EOGM，THEEARLIESTOLIGOCENEGLACIALMAXIMUM以及中中新世变冷事件等，导致地球上的气候发生很大波动。古新世始新世最热事件PETM，又被称为晚古新世最热事件LPTM，LATEPALEOCENETHERMALMAXIMUM27，是指古新世末始新世初（约55百万年前），全球平均气温在很短的时间内升高48的地质事件。温度的迅速升高直接导致全球的动、植物分布和丰富度发生大幅度波动28。全球气温上升使得高纬度地区的生态环境变得更适合植物生长，原本分布于热带、亚热带的植被，尤其是较高等的被子植物，开始向高纬度地区扩张。作为先锋物种，被子植物先一步进入新的环境，为附生在其枝干上的耳叶苔科植物向高纬度扩张创造了条件2,29。在渐新世初期（大约34MA年前），全球气候开始由温暖湿润向寒冷干燥转变30,31，这对各种植物对环境改变的适应能力是一种严峻的考验。一些不适应这种气候变化的植物类群或者向低纬度地区退缩，或者通过进化适应这种寒冷的气候，进而形成新的物种。耳叶苔科虽然是一类较低等的植物类群，但对温度的波动和干旱有一定的抵抗能力，我们推测耳叶苔科极有可能通过演化适应了这种“恶劣”的环境，进而发生了物种的快速分化。因此我们推测，进入白垩纪之后，被子植物的繁盛为低等的耳叶苔科植物提供了复杂多样的生存环境，再加上新生代之后一系列重大地质事件所导致的地球气候剧烈波动的影响，耳叶苔科发生了物种的“辐射式”增长（苏老师等人的文章）。序列变异分析显示耳叶苔科D1蛋白是高度保守的，353个氨基酸残基中只有18个（占序列全长的51）发生变异，其中只有12个位点位于功能结构区且变异度都不高。PAML和DATAMONKEY的分析结果也显示D1蛋白是高度保守的。其中PAML位点模型中的M2A模型检测到D1蛋白中977的位点高度保守（1作为判断正选择的标准只能检测到非同义突变统计上显著高于同义突变的正选择位点。而PSBA基因是一个非常古老的基因，其适应性进化有可能发生在早期并被固定下来，那么利用现存的基因序列作为研究材料，就无法准确鉴定出在其“祖辈”中发生了适应性进化并被固定下来的正选择位点。参考文献1胡人亮苔藓植物学M上海高等教育出版社,19872吴彦君,于晶,曹同8种耳叶苔属植物的孢子形态及壁层结构电镜观察J武汉植物学研究,2008,26（4）3373423吴鹏程苔藓植物生物学M北京科学出版社，19984ZHONGZHP钟珍萍,WUNH吴乃虎AREVIEWOFTHESTRUCTUREANDEXPRESSIONOFPLANTPHOTOGENEPSBAJJOURNALOFFUJIANAGRICULTURALUNIVERSITY福建农业大学学报,1997,263257261INCHINESE5马建忠叶绿体基因组的模式基因光系统32KDA蛋白基因PSBA的研究J生物技术通报，1993，（5）22236李晓鹏PS反应中心D1蛋白的小肽抗体的制备和鉴定J生物化学与生物学进展,1997,（3）2832857郭延平,刘辉,胡美君,等植物PS反应中心D1蛋白的结构与功能J园艺学进展第七辑,2006,3263318YANGZCOMPUTATIONALMOLECULAREVOLUTIONMOXFORDOXFORDUNIVERSITYPRESS,20069THOMPSONJD,GIBSONTJ,PLEWNIAKF,JEANMOUGINF,HIGGINSDGTHECLUSTAL_XWINDOWSINTERFACEFLEXIBLESTRATEGIESFORMULTIPLESEQUENCEALIGNMENTAIDEDBYQUALITYANALYSISTOOLSNUCLEICACIDSRES,1997,25244876488210DRUMMONDAJ,RAMBAUTABEASTBAYESIANEVOLUTIONARYANALYSISBYSAMPLINGTREESJBMCEVOLBIOL,2007,721422111POSADAD,CRANDALLKMODELTESTTESTINGTHEMODELOFDNASUBSTITUTIONJBIOINFORMATICS,1998,1481781812RAMBAUTA,DRUMMONDAJ2009TRACERV141HTTP/TREEBIOEDACUK/SOFTWARE/TRACER/2009092113YANGZPAML4PHYLOGENETICANALYSISBYMAXIMUMLIKELIHOODJMOLBIOLEVOL,2007,241586159114NIELSENR,YANGZLIKELIHOODMODELSFORDETECTINGPOSITIVELYSELECTEDAMINOACIDSITESANDAPPLICATIONSTOTHEHIV1ENVELOPEGENEGENETICS,1998,148392993615YANGZMAXIMUMLIKELIHOODESTIMATIONONLARGEPHYLOGENIESANDANALYSISOFADAPTIVEEVOLUTIONINHUMANINFLUENZAVIRUSAJMOLEVOL,2000,51542343216YANGZ,NIELSENRSYNONYMOUSANDNONSYNONYMOUSRATEVARIATIONINNUCLEARGENESOFMAMMALSJMOLEVOL,1998,46440941817YANGZ,WONGW,NIELSENRBAYESEMPIRICALBAYESINFERENCEOFAMINOACIDSITESUNDERPOSITIVESELECTIONJMOLBIOLEVOL,2005,221107111818ZHANGJ,NIELSENR,YANGZEVALUATIONOFANIMPROVEDBRANCHSITELIKELIHOODMETHODFORDETECTINGPOSITIVESELECTIONATTHEMOLECULARLEVELJMOLBIOLEVOL,2005,22247219KOSAKOVSKYPONDSL,FROSTSDWNOTSODIFFERENTAFTERALLACOMPARISONOFMETHODSFORDETECTINGAMINOACIDSITESUNDERSELECTIONJMOLBIOLEVOL,2005,2251208122220FARESMA,MCNALLYDCAPSCOEVOLUTIONANALYSISUSINGPROTEINSEQUENCESJBIOINFORMATICS2006,22222821282221ARNOLDK,BORDOLIL,KOPPJ,ANDSCHWEDET2006THESWISSMODELWORKSPACEAWEBBASEDENVIRONMENTFORPROTEINSTRUCTUREHOMOLOGYMODELLINGBIOINFORMATICS,22,19520122SCHWEDET,KOPPJ,GUEXN,ANDPEITSCHMC2003SWISSMODELANAUTOMATEDPROTEINHOMOLOGYMODELINGSERVERNUCLEICACIDSRESEARCH313381338523GUEX,NANDPEITSCH,MC1997SWISSMODELANDTHESWISSPDBVIEWERANENVIRONMENTFORCOMPARATIVEPROTEINMODELLINGELECTROPHORESIS,182714272324JRNHENTSCHEL,MATTHEWJVONKONRAT,TAMSPCS,ALFONSSCHFERVERWIMP,AJONATHANSHAW,HARALDSCHNEIDER,JOCHENHEINRICHSMOLECULARINSIGHTSINTOTHEPHYLOGENYANDSUBGENERICCLASSICATIONOFFRULLANIARADDIFRULLANIACEAE,PORELLALESMOLECULARPHYLOGENETICSANDEVOLUTION2009，5214215625JOCHENHEINRICHSETALEVOLUTIONOFLEAFYLIVERWORTSJUNGERMANNIIDAE,MARCHANTIOPHYTAESTIMATINGDIVERGENCETIMESFROMCHLOROPLASTDNASEQUENCEUSINGPENALIZEDLIKELIHOODWITHINTEGRATEDFOSSILEVIDENCEJMOLECULARPHYLOGENETICS,2007,561314426陆钧,陈木宏新生代主要全球气候事件研究进展J热带海洋学报,2006,256727927ZACHOSJC,LOHMANNKC,WALKERJCG,ETALABRUPTCLIMATECHANGEANDTRANSIENTCLIMATESDURINGTHEPALEOGENEAMARINEPERSPECTIVEJJOURNALOFGEOLOGY,1993,10119121328KENNETTJP,STOTTLDABRUPTDEEPSEAWARMING,PALEOCEANOGRAPHICCHANGESANDBENTHICEXTINCTIONSATTHEENDOFTHEPALAEOCENEJNATURE,1991,353319232229SCHNEIDERH,SCHUETTPELZE,PRYERKM,ETALFERNSDIVERSIFIEDINTHESHADOWOFANGIOSPERMSJNATURE,2004,428698255355730COXALLHK,WILSONPA,PLIKEH,ETALRAPIDSTEPWISEONSETOFANTARCTICGLACIATIONANDDEEPERCALCITECOMPENSATIONINTHEPACIFICOCEANJNATURE,2005,433535731TRIPATIA,BACKMANJ,ELDERF