蛋白质的化学修饰.ppt

1、蛋白质分子量测定,蛋白质性质鉴定 蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术,是确定蛋白质产品的是与非的问题,尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。,蛋白质鉴定的主要参数 蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参数很多.但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下几种。 (1)蛋白质的质量鉴定(分子量) (2)蛋白质带电性鉴定（等电点） (

2、3)蛋白质结构鉴定(一、二级结构、晶体、肽谱、NC-末端) (4)蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学) (5)免疫学鉴定（抗原-抗体反应、酶联免疫反应）,意义,确定分子大小 从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基酸组成 验证已测定的一级结构是否正确,常用测定分子量的方法,SDS-PAGE 凝胶过滤层析 质谱 核磁共振,一、SDSPAGE测定蛋白质的相对分子量,【基本原理】 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。 这种迁移率的不同，就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。,当电泳体系中含有一定

3、浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可推测蛋白质的分子量。,SDS的作用原理 SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。,蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷的差异。 并且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。,同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，均是长椭圆状。 因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物

4、的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关。,当SDS的总量为蛋白量的310倍且SDS单位浓度大于1 mol/L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。,组成 该电泳系统由两层不连续聚丙烯酰胺凝胶组成 上层胶:浓缩胶(stacking or concentration gel) 浓 度 2-5%，缓冲液pH值为6.8 下层胶：分离胶(seperation or resolving gel) 浓 度 5-20%，缓冲液pH值为8.3,特点 具有很高的分辨力，这是因为它具有以下三种效应： 样品浓缩效应 A. 分离胶的阻力（孔径小），浓缩作用 B.

5、 缓冲液离子成分的不同 （甘氨酸离子 （慢）氯离子（快），压缩作用 C .浓缩胶与分离胶之间pH值差（分离胶pH高， 调节慢离子的迁移率）,分子筛效应 大分子运动慢，小分子运动快 电荷效应 带电荷多的运动快，带电荷少的运动慢,【器材】 电泳仪、 垂直板电泳槽、 进样器、 乳头吸管、 50 ml小烧杯,【试剂】1标准蛋白质：,30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺29.2 g， 甲叉双丙烯酰胺0.8 g， 加水至100 ml，棕色瓶4保存。 1.5 mol /L Tris-Hcl分离胶缓冲液pH8.8（4x） 取18.15 g Tris， 用1M HCl调pH至 8.8，加水 至100 ml，4保存 0.

6、5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲液pH6.8 （4x） 取5.98 g Tris，用1N HCl调至pH6.8，加水至 100 ml，4保存。,5. 电极缓冲液（pH 8.3） 取 14.49 g甘氨酸，3.02 g Tris，加100 ml 10%SDS，加水至1 升，4保存。6. 10% SDS 取10g SDS，加水至100 ml，完全溶解后室温保存。7. 10%过硫酸铵溶液（AP） 临用前现配。,8染色液（0.25% R-250、50%甲醇、7%乙酸） 考马斯亮蓝R-250 2.5 g、 甲醇（可用无水乙醇代替） 500 ml、70 ml冰乙酸， 溶解后补足水至总体积100

7、0 ml。9脱色液（30%甲醇、7%乙酸） 甲醇（可用无水乙醇代替） 300 ml，冰乙酸70 ml， 补足水至1000 ml。,10样品缓冲液（2x） H2O 2.4 ml，浓缩胶缓冲液1.0 ml、甘油0.8 ml、10% SDS 3.2 ml，b-硫基乙醇0.4 ml，0.025%（W/V）溴 酚兰0.2 ml。11TEMED（四甲基乙二胺） Tetramethylethylenediamine,分离胶和浓缩胶的配制,将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。将胶板垂直放于室温下，待分离胶聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸吸干。,灌胶时要注意,催化剂不能加多了，加完催化剂要

8、充分混匀，且立即灌胶， 灌胶时要保持小烧杯摇动，防止烧杯内的胶聚合。 灌胶动作要快，吸一满管的凝胶后，立即沿胶板的一角灌入，而且要防止气泡的产生。,样品预处理 取样品液与等体积样品缓冲液混合，100加热12分钟。 待浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，然后将胶板固定于电泳装置上，上下槽各加入电极缓冲液。加样 用微量进样器加样。每个样品孔加入20ul样品。同时加一个标准品。,【电泳】 在100 V的电压下电泳，当样品全部进入分离胶时，加大电压至100 V，当溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。,【染色】 从电泳装置上卸下玻板，小心橇开玻板取出凝胶，放入染色液中染色30 min。,【脱色】 移出凝胶放入脱色液

9、中脱色至本底无色为止。,【观察电泳结果】,根据标准样品，大致推测蛋白质的分子量。,用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率（R）： 相对迁移率 = 样品迁移距离（cm）/ 指示剂迁移距离（cm） 以标准蛋白质Mr的常用对数（lgMr）对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子量的常用对数，再换算出其相对分子量。,二、根据化学组成测定分子量,二、凝胶过滤法,凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶具有特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗

10、脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准曲线上可以求出此未知蛋白质对应的分子量。,层析法装置,优点 分离条件温和 回收率高 重复性好 设备简单 缺点 对样品的稀释大 流速慢 操作费时,三、质谱法,【原理】 质谱仪是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经过加速进入磁场中。其动能与加速电压及电荷Z有关。 Z：电荷数 ZeU=mv2/2 e：电荷(e = 1.60 x10-19C) U：加速电压 m：离

11、子的质量 v：离子被加速后的运动速度,具有速度v的带电离子进入质谱仪的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按m/z进行分离。 根据质量分析器的工作原理，可将质谱仪分为动态和静态仪器两大类，静态仪器采用稳定的电磁场，按空间位置来区别m/z不同的离子。动态仪器采用变化的电磁场，按时间不同来区分m/z不同的离子。 分离生物大分子多采用电喷质谱法，属于动态质谱仪。基本原理是生物大分子在很高的电场下电离。样品溶液以很低的流速，在高的电场下使生物分子从毛细管中流出來。,【方法】 样品溶液以很低的流速(1-20l/分钟)从毛细管中流出来。在毛细管的柱头上施加一个高电压(1-5kv)，使柱头液体雾

12、化成很细的带电液滴，这种带电液滴在逆向干燥气流中挥发，使液滴表面电荷密度增大。直到产生的库仑斥力与液滴表面张力的雷利极限值相等时，液滴就会发生爆裂，形成更小的子液滴，这些子液滴又被蒸发，又会形成爆裂。如此循环下去，直到液滴变得非常小，它的表面的电荷密度变得非常大，形成很强的电场，并从液滴中解离出带多电荷的分子离子。这些离子是靠吸附上或丢失若干质子而形成的，所以正离子或负离子谱上会观察到谱峰。生物大分子在ESI谱上往往是一组带不同的电荷的分子离子峰。,核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).是将具有磁矩的核放入磁场后，用适宜的频率

13、的电磁波照射，它们就会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振波谱。在有机化合物中，经常用于1H和13C核的共振吸收波谱。在生物学方面主要研究生物大分子的结构和分子量。到目前为止，采用1H 2D-NMR（二维NMR）能解决的最大蛋白质分子量在10000Da左右。如果采用杂核多维NMR技术，能解决的最大蛋白质分子量大在25000Da左右。,四、核磁共振波谱,几种测定蛋白质分子量的方法比较,蛋白质的化学修饰,概 念,从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白质的化学修饰。 包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2）主链结构的改变，前

14、者属于化学修饰的范畴，而后者则属于基因重组和定点突变的方法。,蛋白质化学修饰的意义,改变蛋白质的药代动力学 调节蛋白质的稳定性以及活性 改变蛋白质的空间构象,化学修饰的原理,影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有： 1 蛋白质功能基的反应性（亲核性） 1.1 基团之间的氢键及静电作用 1.2 基团之间的空间位阻 2 修饰剂的反应性 2.1 选择吸附 2.2 静电相互作用 2.3 位阻因素,化学修饰的方法学,1 试剂的选择 水解稳定性； 蛋白质的修饰位点，反应类型以及专一性； 修饰剂的大小； 连接键的稳定性、毒性和抗原性； 修饰后是否需要进一步的分离； 是否适于建立快速、方便的分析方法； 是否能够简

15、便经济的合成或购买,反应条件的选择 考虑因素包括pH、反应温度、反应介质以及缓冲液组成 允许反应顺利进行 不能造成蛋白质的不可逆变性 有利于专一性修饰蛋白质,修饰反应的类型,酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应,二硝基氟苯法(FDNB,DNFB): 1945年Sanger提出此方法.,巯基的氧化还原反应可以应用于蛋白质结构分析、包涵体的复性、增加蛋白质可溶性等。,SDS PAGE: Refolded vs Unfolded,Reduced,Oxidized,Figure Inclusion bodies expressed in E.coli.,蛋白质的PEG修饰,聚乙二

16、醇(polyethyleneglycol, PEG)修饰又称分子的PEG化(PEGalation),是目前蛋白质化学修饰最重要的技术之一,是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效途径。,PEG是由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料,分子组成为HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH; PEG链还可以与马来酸酐进一步共聚形成梳状的PEG衍生物,简称PM。 PEG分子中存在的大量乙氧基能够与水形成氢键,使PEG具有良好的水溶性;分子末端剩余的羟基通过适当方式活化后可与各类蛋白分子相偶联。,由于PEG无毒,具有良好生物相容性和血液相容性,使它成为一种

17、被广泛使用的生物修饰材料。对于各种具有药用潜能的蛋白来说,采用PEG修饰的目的主要有以下三个方面:(1)增加稳定性,延长血浆半衰期;(2)降低免疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。,1 增加稳定性和延长血浆半衰期 一些以注射方式使用的药用蛋白,由于在血液中存留的时间过短,在很大程度上限制了其正常药效的发挥。通过PEG修饰,一方面增加了分子量,降低了肾脏的排泄速率;另一方面,偶联的PEG链在蛋白分子表面产生空间位阻效应,减弱了血液中各种水解酶对蛋白的水解作用,从而有效地延长了蛋白在循环系统内的保留时间。,2降低抗原性和免疫原性 通过PEG修饰来消除免疫反应活性,将异源性蛋白转化为非免疫原性的药用

18、蛋白,主要是利用无免疫原性的PEG分子链与蛋白表面的基团相偶联,进而在蛋白表面形成一道屏障,将暴露的抗原结合位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状PEG具有更强的屏蔽功能,因而在这方面的应用更为普遍。,3降低毒副作用 通过基因重组技术获得的大规模生产的TNF-a,IL-2 和IFN-g等是一类很有前途的抗肿瘤新药。但由于它们的血浆半衰期短,为达到显著的临床治疗效果不得不加大使用剂量,这就常常引起严重的毒副作用。近年来发现,利用PEG修饰技术对这些蛋白进行处理后,能够大大增加其血浆稳定性,降低使用剂量;或在大的使用剂量下降低毒副作用。近年来,PEG修饰已成为提高其抗肿瘤效能、降低毒副作用的有效手段。,

19、PEG对蛋白药物修饰的研究及应用进展 蛋白药物的PEG修饰已卓有成效，国际知名的制药公司已经或正在积极推进蛋白药物的PEG修饰，1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被FDA批准上市，近几年上市的有PEG-IFN、PEG-G-CSF、PEG-生长抑素。目前处于临床前研究的PEG修饰的蛋白药物有几十种，处于临床实验的有：超氧化物歧化酶（即将上市，Enzon公司）、白介素-2（期，Chiron公司）、水蛭素（期，BASF AG公司）、抗-TNF-a抗体片段（期，Pharmacia公司）、牛血红蛋白（期，Enzon公司）、抗-PDGF抗体片段（期，Celltech公司）。,TNF-a是

20、一种颇有价值的肿瘤治疗药物, 一方面直接表现为对肿瘤细胞的细胞毒作用;另一方面可激活宿主的抗肿瘤应答并选择性地引起肿瘤组织内部的微循环障碍。但是, TNF-a在体内的清除速率很快,要产生明显的抗肿瘤效果需要非常大的使用剂量,由此常引发一系列严重的毒副作用,包括发热、组织炎症和组织损伤,甚至是致命的内毒素性休克样综合征。要将其转化为一种有效的抗肿瘤药物必须有效地降低毒副作用,PEG修饰正是为达到这一目的。研究表明,利用PEG 5000对TNF-a进行化学修饰,通过对修饰条件的优化处理,不仅能够有效减少毒副作用,还可提高其抗肿瘤活性。当赖氨酸残基被修饰的程度分别为29%和56%时,其抗肿瘤活性分别

21、增加了4倍和100倍。与天然TNF-a相比,修饰产物的分子量明显增大,延长了药物的有效作用时间,降低了毒副作用,促进了它作为抗肿瘤药物的应用。,Figure Schematic protocol of PEGylation of TFN-a using DMMAn. Reaction I, protection of partial amino groups by DMMAn; reaction II, PEGylation to remained lysine amino groups; reaction III, regeneration of amino groups by releasing DMMAn,Resistance of native TNF- a and PEG-TNF-ato proteases. Native TNF-a or PEG-TNF-a was incubated with trypsin (left) or cathepsin G (