5连接_2011年分子生物学实验.ppt

1、实 验 三,DNA片段的回收（续）,取上一实验回收的无水乙醇沉淀的DNA管。 12000rpm离心10mins，弃上清。 用75%乙醇0.5ml洗涤沉淀，12000rpm离心2mins，弃上清。 空气干燥10mins 加入10uL TE 溶解回收产物。 分别标记组号，注明5.3kb 或0.7kb 电泳定量,沉淀和溶解,电泳分析定量计算定量结果：确认回收片段，测定浓度并计算回收量。,制胶: 四人一块胶，1%琼脂糖凝胶，20ml 上样电泳: 1. Marker 5uL （0.75ug） 2. 5.3Kb 2uL 3. 0.7Kb 4uL （注意：样品加入10 x loading buffer混匀后

2、再上样),2.2.4 观察结果,计算公式:,DNA片段的重组（连接反应）,实 验 四,背景理论知识,Section 1,BamHI（661）,NotI（1398）,pEGFP-N3 4.7kb,EGFP(720bp),EGFP(720bp)-BamHI-NotI,pET28a(5.3kb)-BamHI-NotI,Ligation,4.1.1 实 验 目 的,学习克隆工作中常用的单、双酶切，载体去磷酸化处理等连接方法 了解反应中各因素对连接效率的影响,4.1.2【实验原理】,DNA重组：在DNA连接酶的作用下,在含有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行

3、连接,获得重组DNA分子。,T4DNA连接酶：ATP是辅助因子； 大肠杆菌DNA连接酶NAD+是辅助因子。,DNA连接酶,将具有相同粘性末端或平端的DNA分子连接起来。 DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。 T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子,4.1.2【实验原理】,特点： 催化DNA 5磷酸基与3羟基之间（切口）形成磷酸二酯键。切口(nick)：DNA分子糖-磷酸主键的破坏。缺口(gap)：DNA分子中核苷酸缺失。,4.1.2【实验原理】,DNA连接酶： T4噬菌体DNA连接酶（可连接平末端双链DNA） 大肠杆菌D

4、NA连接酶 连接酶单位： Weiss单位（ppi单位）：37C、20分钟内将1nm的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上. 个Weiss单位相当于60个粘端单位 反应温度：最佳温度37C 一般采用4-16 C,4.1.3 影响连接反应的因素,反应温度 连接酶的用量 DNA末端的性质 DNA浓度及两种DNA分子数的比例,外源DNA末端的性质,带有不同突出末端的片段 双酶切：末端不同；可定向连接 带有相同突出末端的片段 单酶切：末端相同;大量无效连接产物 如载体自环化，引起转化子高本底 解决办法：5末端去磷酸化 （CIP小牛肠碱性磷酸酶）,定向克隆,返回,利用CIP防止载体DNA的重新环化,4.1

5、.4载体、供体浓度及比例,通过控制插入片段与载体之间的比例以达到最大效率的重组连接。 最佳比例是由构造及末端的类型决定的。 一般需要较高的插入片段与载体的摩尔比例。 如2：1 甚至4：1，今天我们采用3：1 插入片段与载体的DNA的最适总浓度：一般载体用100ng,插入片段用量根据比例计算确定。,4.1.4载体、供体浓度及比例,重组DNA片段摩尔比例的换算： 100ng pET28a (5.3kb) ：100ng eGFP(0.7kb） =？ 1 : 7.5,实验操作,Section 2,4.2.1实验材料,pET28a BamHI-NotI 酶切质粒载体片段。 eGFP BamHI-NotI 酶切目的片段。 T4DNA连接酶 其它,将插入片段与载体片段按3:1的比例 载体 2l (100ng) 目的片段(1.4kb) ?l (100ng)6l T4连接酶缓冲液 1l T4连接酶 1l ddH2O 0l 反应总体积 10l 混合于EP管(标记)中且混匀,Short离心,4.2.2【实验步骤】,16 C保温14 小时,若不马上转化, -20C保存,该连接产物是下次实验材料,思 考 题,单酶切重组DNA有哪些弊