生化实验：血清清蛋白的分离与电泳鉴定（修改）

1、1,血清清蛋白的分离与电泳鉴定,2,临床意义,血清清蛋白增高 严重失水，血浆浓缩所致。尚未发现单纯清蛋白浓度升高的疾病。,2.血清清蛋白降低 急性清蛋白浓度降低主要见于大量出血和严重灼伤。 慢性清蛋白浓度降低主要见于肝、肾疾病,3,一、实验目的,1.掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实 验原理及操作技术。 2.熟悉醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质的方法和应用。,4,二、实验原理,实验流程,盐析,脱盐,电泳,5,常用的蛋白质分离纯化技术,溶解度,盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀,分子大小,透析、超过滤,密度梯度离心、凝胶过滤,带电特性,电泳、离子交换层析,吸附特性,吸附层析,对配体分子的亲和性,亲

2、和层析、金属螯合层析,6,透 析,7,超 滤,8,电 泳 法,层 析,11,12,1.强酸型阳离子交换树脂：主要含有强酸性的反应基如磺酸基（SO3H），此离子交换树脂可以交换所有的阳离子。 2. 弱酸型阳离子交换树脂：具有较弱的反应基如羧基（COOH基），此离子交换树脂仅可交换弱碱中的阳离子如Ca2+ 、Mg2 +,13,二、实验原理（盐析）,在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。 蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜和电荷。 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 1. 破坏水化膜，暴露出疏水区域， 2. 中和电荷，破坏亲水溶胶,14,二、实验原理（盐析）,溶解度,盐浓度,Sa

3、lting-out,Salting-in,+,+,+,+,+,+,+,+,等电点时的蛋白质（亲水胶体）,带负电荷蛋白质（亲水胶体）,脱水,不稳定蛋白颗粒,碱,酸,酸,蛋白质聚集沉淀,带正电荷蛋白质（亲水胶体）,碱,水化膜,分段盐析,不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,半饱和,饱和,析出,析出,17,二、实验原理（脱盐凝胶层析）,原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以

4、大分子物质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。,二、实验原理（电泳）,以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动，由于迁移率不同而被分离。,分子量,分子形状,净电荷量,相对迁移率,20,三、实验步骤（盐析）, 取2ml血清稀释液于10ml刻度试管。 逐滴加入2ml饱和(NH)SO溶液， 滴入后，立即摇匀，边加边摇。 混匀后于室温中放置10min。 蒸馏水润湿后的双层滤纸过滤，弃沉淀，留滤液。,21,三、实验步骤（脱盐凝胶柱层析）, G-25混匀后上柱 一气呵成，无气泡，无断层。

5、 调流速 20滴/min。 上液面与凝胶面齐平时，加样1ml滤液；再次齐平时，加蒸馏水。收集洗脱液，每管15滴。全程凝胶柱不能干！ 检测。 一同学收集，另一检测。 收集液一半用10%三氯醋酸（2滴）检测，沉淀最多的电泳。 继续蒸馏水，用1%BaCl2检测无白色后封柱。,三、实验步骤（电泳）, 画点样线 无光泽面，距一端2cm铅笔画点样线。 浸泡薄膜后，滤纸拭干（不能有多余水渍，也不能晾干薄膜）。 点样 蘸层析液于点样线上方（量多），血清下方（1-2mm高度）垂直点样，立刻提起。,2.5cm,粗糙面,姓名,层析液,血清,三、实验步骤（电泳）, 搭桥 点样端于负极，平衡5min 后通电。 电泳100V，30min 氨基黑10B染色，5min。 漂洗2次，每次3min。 除漂洗液外，其余溶液均回收。,影响电泳速度的因素,（1）样品本身：带电量、分子大小、形状。 （2）电场强度：X越大，V越大 （3）缓冲液： pH 决定Q，(pH-PI)越大，Q越多，V越大,三、实验结果,结果分析, 2 1,albumin,-,+,层析液,结果,血清,实验名称 摘要（