MSCs诱导成骨分化说明书 翻译版

1、【成骨培养基】oricelltm间充质干细胞成骨分化培养基由优化的间充质干细胞(msc)成骨分化基础培养基、细胞培养补剂和预选胎牛血清组成。基础培养基 175 ml胎牛血清 20 ml青霉素-链霉素 2 ml谷氨酰胺 2 ml抗坏血酸盐 400 ul -甘油磷酸盐 2 ml地塞米松 20 ul茜素红s 10 ml一、完全培养基的制备1. 使用前，将符合msc标准的胎牛血清于2-80温度下隔夜解冻或完全解冻。轻轻旋转瓶子，确保均匀。血清已热灭活，解冻后即可使用。注:解冻血清中可能含有絮状沉淀物。血清中这些物质的存在不会改变产品的性能特征。不建议通过过滤血清来去除这些沉淀。因此，可能会导致一些血清

2、营养素的损失。2. 使用前约30分钟，室温解冻抗坏血酸盐、-甘油磷酸盐、青霉素-链霉素溶液、谷氨酰胺溶液。轻轻倒瓶几次，确保均匀。3. 使用前约10分钟，在室温下解冻地塞米松。注:取下瓶盖前，先低速离心，以保证全部内容物的回收。4. 用70% v/v乙醇对试剂盒中每个组件的瓶/瓶外表面消毒，让乙醇蒸发。5. 无菌打开层流罩内的瓶子/小瓶。6. 转移全部抗坏血酸，-甘油磷酸盐，胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、谷氨酰胺溶液进入msc成骨分化基础培养基。7. 用少量基础培养基清洗每个小瓶/瓶。然后将漂洗液倒回基培养基瓶中。8. 转移全部地塞米松量，向瓶中加入0.5 ml的培养基，用吸管混合，再将整个混

3、合物倒回基础培养基瓶中。9. 重复几次步骤8。10. 轻轻旋转全部补充(完全)的培养基，以确保混合物均匀。现在可以使用完整的培养基了。注:虽然本试剂盒中的每个组件都是无菌提供的，但强烈建议过滤完全培养基。二、组织培养血管明胶涂层1. 在培养皿中加入0.1%的明胶溶液，完全盖住培养基。2. 旋转，直到凝胶溶液均匀地覆盖整个容器底部。在室温下放置30分钟。3. 将所有明胶溶液吸出，并在层流罩/生物安全柜内打开的容器中放置不超过30分钟，使残留的明胶溶液蒸发。4. 待培养容器干燥后，将其密封。三、成骨（六孔板）1. 将oricelltm mscs在37的oricelltm mscs培养基中，5% c

4、o2加湿培养箱中培养。2. 当细胞约80-90%融合时，可与0.25%胰蛋白酶- 0.04% edta分离。3. 将生长培养基中的msc以2104细胞/cm2的密度重新播种在预涂0.1%明胶溶液的6孔板中。4. 在37、5%的co2加湿培养箱中孵育细胞。5. 当细胞融合约60-70%时，小心地吸取生长培养基，加入2 ml oricelltm间充质干细胞分化培养基。6. 用新鲜的oricelltm间充质干细胞成骨分化培养基（37预热）每3天换液一次，持续2-4周。7. 分化2-4周后，细胞固定，用茜素红s染色。注:为防止成骨细胞脱离，建议分析前每2天更换半份培养基。四、茜素红s染色分析1. 细胞分化完成后，取出成骨分化培养基，用1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗。用2 ml 4%甲醛溶液固定细胞30分钟。2. 用1x pbs冲洗两次。用1ml茜素红s液对细胞染色3-5分钟。3. 用1x pbs冲洗2-3次。4. 细胞现在可以在显微镜下观察和分析。五、稳定和储存所有产品应存放在暗处。msc成骨分化基础培养基和茜素红s在2-8稳定1年，其他在