味精工艺04.ppt

1、第三章 谷氨酸的发酵,目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌等。,谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成-酮戊二酸。-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。 在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞

2、外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。,第一节 培养基及设备的灭菌,一、定义 1 、培养基灭菌的定义 是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常

3、用。 2 、灭菌与消毒的区别 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。,二.湿热灭菌的原理 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。 湿热灭菌中的相关定义 杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。 微生物的热阻：是指

4、微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,三、培养基连续灭菌 1，连续灭菌的设备 维持罐 灭菌系统中的维持设备，主要是使加热后的培养基在维持设备中保温一段时间，以达到灭菌的目的，也称保温设备,培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。 培养基

5、的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。,影响灭菌的因素 微生物细胞中水分对灭菌的影响 细胞含水越多，蛋白质变性的温度越底 微生物细胞菌龄对灭菌的影响 老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高 空气排除情况对灭菌的影响 搅拌对灭菌的影响 泡沫对灭菌的影响,第二节 空气除菌的工艺及设备,无菌空气的概念 发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中

6、含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。 空气中微生物的分布 空气中的含菌量随环境不同而有很大差异： 一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多； 人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多； 地面又比高空的空气含菌量多。 各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103104个m3进行计算。,空气除菌的方法 辐射灭菌 加热灭菌 静电除菌 介质过滤,1.3应用范围 通常用于无菌室和医院手术室。 缺点 杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。,介质过滤除菌的

7、机理 过滤除菌-利用有孔介质从气体中除去微生物,孔,过滤器经常被认为是一种简单的网或筛子， 过滤 / 分离是在一个平面上进行的。,两级冷却、分离、加热的空气过滤除菌流程,流程的特点是：两次冷却，两次分离，适当加热,预过滤器,气体预过滤器外壳图,气体预过滤器结构图（单芯）,气体预过滤器结构图（多芯）,附属设备. 粗过滤器 作用：是捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受磨损，同时也可减轻总过滤器负荷。 要求：过滤效率要高，阻力要小；否则会增加压缩空气的吸入负荷和降隐低压缩空气机的排气量。 常用的粗过滤器有： 布袋过滤 填料过滤 油浴洗涤 水雾除尘,第二节 谷氨酸的发酵,氨基酸发酵属于典型的代谢控制发酵，

8、这是由于氨基酸的生物合成受到严格的反馈调节。 要进行氨基酸发酵，就必须采取某些人为的手段以打破微生物的反馈调节机制，从而大量积累目的氨基酸。,一、菌种 现在经过鉴定和命名的谷氨酸生产菌很多，主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。 它们有很多相似点：革兰氏阳性；不形成芽孢；没有鞭毛，不能运动；都需要生物素作为生长因子；都具有一定的过量合成谷氨酸能力,目前国内大多数厂家使用的菌种是天津工业微生物研究所选育的天津短杆菌T6-13及其变异株（如复旦大学选育的FM-415、华南理工大学选育的S9114、浙江工学院选育的LS168和天津轻工业学院选育的TG931等菌株）。,二、谷氨酸生物合

9、成途径及调节机制,谷氨酸发酵是氮素同化发酵，氨的导入是氨基酸发酵最基本的过程，从谷氨酸生物合成途径可知，氨的导入有三种方式： 一是糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸； 二是由天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给-酮戊二酸而生成； 三是谷氨酸合成酶途径。,在谷氨酸发酵中，糖代谢既受生物素的控制（生物素增加糖代谢的速度，生物素充足时HMP途径在糖酵解中所占比率较高），又受NH4的影响。 使用生物素缺乏菌，在NH4存在时，葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸；当NH4不存在时，糖的消耗速度很慢，生成物是-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸，但在生物素充足时，NH4几乎不影响糖代谢。,

10、细胞膜通透性的调节 谷氨酸的分泌取决于细胞膜的通透性。根据控制机制可将控制因素分为两类： 一是生物素、表面活性剂、高级饱和脂肪酸（酯）、油酸及甘油的作用； 二是青霉素的作用,二、谷氨酸发酵工艺,L-谷氨酸发酵生产工艺主要包括如下工序： 原料预处理； 培养基配制； 种子培养； 发酵； 谷氨酸提取与精制。,国内谷氨酸发酵种子扩大培养普遍采用二级种子培养的流程，即： 斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养 发酵罐 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32培养18-24h,一级种子的常用培养基配方,L-谷氨酸发酵原料的预处理 已知所有谷氨酸产生菌都不能直接利用淀粉或糊精

11、，而只能以葡萄糖等作为碳源。所用的山芋淀粉、玉米淀粉、大米或木薯淀粉都需先进行水解，制成葡萄糖。 1）酸法制水解糖液 2）酶法制水解糖液 3）糖蜜原料：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜中都含有丰富的生物素，不宜直接作为谷氨酸发酵的碳源，发酵前必须进行预处理，去除生物素或将其破坏。,谷氨酸发酵培养基的配制 1）培养基 2）发酵培养基中生物素的控制 亚适量。 3）发酵培养基中的氮源,谷氨酸分子中氮含量占9.5%，所以培养基中必须提供相对充足的氮源。 谷氨酸产生菌的生长和产物合成时期需维持在pH7.0-7.2，而且培养基中铵离子浓度又不宜太高，因此，不宜采用硫酸铵、氯化铵等生理酸性铵盐。 氨水也可作为氮源，但由于

12、加入后培养基pH波动太大，故需要采取连续流加方法。 尿素是国内谷氨酸发酵中较常用的氮源，因为谷氨酸产生菌具有高活力的尿酶，故可采用分批流加方法，使尿素经尿酶分解而提供铵离子。 现在，比较常用的是通入气态氨以补充氮源。,谷氨酸发酵生产,发酵初期，糖基本没有利用，尿素分解放出氨使pH值略上升。延滞期的长短一般为2-4h。 接着进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，尿素大量分解，pH值很快上升。但随着氨被利用pH值又下降，溶氧浓度急剧下降，然后又维持一定水平上，菌体浓度迅速增大。 这个时期，为了及时供给菌体生长必需的氮源及调节培养液的pH值至7.5-7.8，必须流加尿素；又由于代谢旺盛，泡沫增加并放出大

13、量发酵热，需加入消泡剂及冷却，使温度维持在30-32。这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。,当菌体生长基本停止就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的-酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。 这一阶段，为了提供谷氨酸合成所需的氨及维持pH值在7.0-7.2，必须及明流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需要加大通气量，并将发酵温度提高到谷氨酸合成的最适温度36-37。,发酵后期，菌体衰老，糖耗缓慢，残糖低，此时流加尿素必须相应减少。当营养物质耗尽酸度不再增加时，需及时放罐。 发酵周期一般为30-36h。,菌龄及接种量的控制 一般情况下，一级种子菌龄控制在1112h

14、，二级种子菌龄控制在78h 接种量0.61.7。发酵培养基成份不同，谷氨酸菌种种类性质、种龄不同，所用接种量也不同，应根据实际情况和实验情况具体确定。一般以1%为好。,温度的控制 前期320.6，后期可提高到3437。谷氨酸发酵前期，主要是长菌阶段，如果温度过高，菌种易衰老，严重影响菌体生长繁殖。因此，温度控制在谷氨酸最适生长温度32左右。在发酵后期，菌体生长基本结束，为了满足大量生成谷氨酸，可适当提高温度，控制在3437。,pH的控制 发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；如果pH偏高，则菌体生长缓慢，发酵时间拉长。在发酵前期将pH值控制在7.58.0左右较为合适，而在发酵中、

15、后期将pH值控制在7.07.6左右对提高谷氨酸产量有利。通常采用氨水流加法和尿素流加法调节pH，这样同时也是添加氮源。,通风量与搅拌速度的控制 在长菌阶段，若供氧过量，在生物素限量的情况下，抑制菌体生长，表现为耗糖慢，长菌慢，所以发酵前期以低通风量为宜。在发酵阶段，若供氧不足，发酵的主产物由谷氨酸变为乳酸，所以发酵中、后期以高通风量为宜。实际生产上，以气体转子流量计来检查通气量，即以每分钟单位体积的通气量表示通风强度。另外发酵罐大小不同，所需搅拌转速与通风量也不同。,三、通风发酵设备,2升试验罐,15升试验罐,中试规模发酵罐,通风发酵罐及结构,通风发酵罐又称好气性发酵罐，如谷氨酸、柠檬酸、酶制剂、抗生素、酵母等发酵用的发酵罐。 好气性发酵需要将空气不断通入发酵液中，以供微生物所消耗的氧。,机械搅拌发酵罐是发酵工厂常用类型之一。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促使氧在发酵液中溶解，以保证供给微生物生长繁殖、发酵所需要