骨髓造血干细胞.ppt

1、造血干细胞移植进展,云南省肿瘤医院血液科 何明生 博士,造血干细胞移植进展,2,1999年12月美国SCIENCE,人类干细胞研究 列入人类十大科学成就 榜首,造血干细胞移植进展,3,2003年度 十大科学进展中同样涉及了干细胞，即鼠的胚胎干细胞在培养皿中既能发育成精子也能发育成卵子，有望发展出新一代的试管婴儿技术。,造血干细胞移植进展,4,hematopoietic stem cell,in PubMed Items 1 - 500 of 56 663 12/5/2005,干细胞移植进展,第一部分 基础理论 第二部分 实验技术 第三部分 临床移植,造血干细胞移植进展,6,1骨髓造血干细胞的基

2、本概念,骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是指存在于骨髓中的一小群具有无限或较长期的自我更新能力,并具有多向分化潜能的原始造血细胞,造血干细胞移植进展,7,1骨髓造血干细胞的基本概念,传统观念认为HSC的生物学特征是： 具有高度增殖分裂能力； 能多向分化产生各系血细胞； 可移植性； 能自我更新(self-renew) ，持久地维持正常造血功能。,造血干细胞移植进展,8,2.骨髓造血干细胞的研究历史,造血干细胞移植进展,9,2.骨髓造血干细胞的研究历史,造血干细胞移植进展,10,造血干细胞移植在近30年里迅猛发展壮大至今,1990年，美国的Thomas因在骨

3、髓移植中做出重要贡献，从而共同获得该年度的诺贝尔生理奖和医学奖，这是临床医学首次获得此项殊荣。,造血干细胞移植进展,11,3. 造血干细胞的体外研究,造血干细胞向红细胞分化 造血干细胞向粒细胞分化 造血干细胞向单核细胞分化 造血干细胞向淋巴细胞分化 造血干细胞向血小板分化 造血干细胞向NK细胞分化,造血干细胞移植进展,12,3. 造血干细胞的体外研究,造血干细胞还可向心肌细胞分化、肝细胞、神经组织细胞、血管内皮细胞等非血液细胞分化,造血干细胞移植进展,13,4造血干细胞的体内特性,骨髓造血干细胞来源于胚胎干细胞的成血血管内皮细胞，经由卵黄囊、胎肝、胸腺、脾、最后到骨髓，在体内不断增殖发育，产生

4、髓系、红细胞系和淋巴细胞系，逐步分化至各系成熟血细胞。,4造血干细胞的体内特性,造血干细胞移植进展,14,4造血干细胞的体内特性,骨髓造血干细胞在体内具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，不断的产生髓系、红系和淋巴系细胞。,4造血干细胞的体内特性,造血干细胞移植进展,15,神经性疾病,南佛罗里达医学院和佐治亚医学院的研究人员在2003年美国神经年会上报告，将血液中的干细胞移植到卒中大鼠的大脑中能大大促进大脑的功能恢复。,造血干细胞移植进展,16,神经性疾病,巴西圣保罗大学的研究小组从30例脊椎损伤所致瘫痪患者的血液中抽取干细胞，再注入患者脊椎动脉血管，几个月后，12例患者的瘫痪肢体恢复了知觉。

5、,造血干细胞移植进展,17,神经性疾病,我们与昆医神经科学研究所的合作研究表明，骨髓的CD34+细胞移植对恢复全脊髓损伤有治疗作用，相关论文正在审稿之中。,造血干细胞移植进展,18,（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究,干细胞移植成为治疗神经系统退行性疾病唯一可能有效的手段。但是，目前NSC移植还未广泛用于临床实践中，原因主要有3点： NSC取材困难，需做开颅手术，对患者创伤较大，给患者带来较大痛苦。再加上神经系统退行性疾病患者多为高龄者，故患者已经受不住神经干细胞移植。,造血干细胞移植进展,19,（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究,NSC分离提纯技术尚未

6、成熟，想要得到一定数量一定纯度的NSC困难较大。 NSC较脆弱，易受各种因素的影响，即使分离提纯出NSC，也很难断定这些神经干细胞仍具有正常功能和特性，以及将这些“神经干细胞”注入神经系统后能否分化为一定数量的神经细胞。,造血干细胞移植进展,20,（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究,与NSC相比HSC具有以下优点： 1）HSC取材容易，无论是骨髓HSC还是外周血HSC的采集都具有创口小、患者痛苦小、安全性高的特点。 2）HSC的分离提纯技术已较为成熟，可较容易的得到一定数量一定纯度的HSC。,造血干细胞移植进展,21,（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究,

7、3）对干细胞的认识首先从HSC开始，因此关于HSC的研究较NSC要深入得多。 4）HSC呈悬浮状态，再采集和培养等过程中损伤较小。,造血干细胞移植进展,22,（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究,临床价值 可将HSC培养分化出“神经细胞” 的特性及功能，将这些“神经细胞”注入神经系统病变局部，从而替代或部分替代受损神经细胞的功能治疗神经系统疾病。 HSC源自患者本人，既可以避免移植后免疫排斥反应，年龄的限制也可延长。,造血干细胞移植进展,23,（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究,预期研究成果 1、骨髓干细胞可诱导分化为具有神经细胞功能的细胞 2、骨髓干细胞

8、诱导分化的神经细胞对脊髓损伤有治疗作用,造血干细胞移植进展,24,第二部分,实验技术,造血干细胞移植进展,25,1.问题,如何取得干细胞 如何体外培养干细胞 如何保持体外培养干细胞的生物学特性,造血干细胞移植进展,26,2.髓造血干细胞的培养原理,骨髓造血干细胞的体外培养指在模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行干细胞的孵育培养，使之生存并生长。造血干细胞体外培养呈悬浮状生长，无需底物支持。,1.体外培养原理,造血干细胞移植进展,27,3.动物取材,在置备细胞悬液之前须将目的细胞所在组织材料分散成单细胞。 机械分离和酶学解离是将组织分散成单细胞最常用的方法。,造血干细胞移植进展,28,3.1

9、细胞悬液的制备,介绍两种方法： 在无菌条件下利用穿刺法从髂骨抽取骨髓，缓慢加入到比重为1.077g/3的淋巴细胞分离液中，经密度梯度离心吸取白细胞层，多次离心后可得到骨髓单个核细胞（BMNC），重新悬浮在含有10U/ml肝素的RPMI-1640液中，制成细胞悬液。,造血干细胞移植进展,29,3.1细胞悬液的制备,介绍两种方法： 无菌条件下从髂骨抽取骨髓经输血滤网过滤后，自然沉淀，去除大部分红细胞，再以200r/min低速离心，漂洗23次去除血浆，保留有核细胞。 然后加入到RPMI-1640液中，制成密度为（15）107MNC/ml的细胞悬液。,造血干细胞移植进展,30,3.2 培养方法,两种常

10、用的干细胞分离方法: 1、免疫亲和柱分离法 2、免疫磁珠分离法,造血干细胞移植进展,31,1）免疫亲和柱分离法,具体方法如下：取收集的单核细胞置于RPMI 1640培养液中，并加入胎牛血清过夜，以除去贴壁的细胞，在形成玫瑰花环的细胞中直接加入生物素标记的抗-CD34单克隆抗体，于4条件下旋转孵育30分钟，然后用Hanks液清洗。,造血干细胞移植进展,32,1）免疫亲和柱分离法,将结合好的细胞放入亲和层析柱中，通过亲和素和生物素的结合作用，标记的细胞被亲和柱吸收，清洗亲和柱除去非特异结合的细胞，即可获得CD34细胞。,造血干细胞移植进展,33,2）免疫磁珠分离法,此法特异性高、纯度好、简便快速、

11、可以处理大量的细胞样品以满足临床移植的需要。,造血干细胞移植进展,34,c 磁珠准备,从被覆绵羊抗小鼠IgG1（Fc）抗体Dynabeads M-450的小瓶中（磁珠密度4108/ml， 30mg/ml），按0.5个磁珠/MNC的比例取出预计磁珠量，用RPMI/HAS漂洗后将磁铁置于试管外壁吸引2分钟，弃去上清液，收集磁珠，加入RPMI/HAS/IG 1ml悬浮磁珠，置于冰浴中，立即使用。,造血干细胞移植进展,35,d 致敏细胞,用CD34单克隆抗体（9C5）按0.5g /106细胞比例致敏细胞，MNC浓度为（15）107MNC/ml，混合均匀后置于4的旋转混合器上以4r/min的速度低速转动

12、孵育3060分钟，用RPMI/HAS清洗细胞后4低速离心5分钟，去除未结合的单克隆抗体，最后将致敏细胞加入RPMI/HAS中形成细胞悬液。,造血干细胞移植进展,36,e 混合,按磁珠与致敏细胞0.5:1的比例将致敏细胞与磁珠结合，在4旋转混合物器上转动混合30分钟，用磁铁在管壁外吸引，收集磁珠-玫瑰花环形成细胞，再用RPMI/HAS漂洗，除去非玫瑰花环形成细胞。,造血干细胞移植进展,37,3）培养造血干细胞的常用方法,液体悬浮培养法 体外集落形成实验 骨髓基质细胞培养法 微载体-微囊培养技术,造血干细胞移植进展,38,4.鉴定结果,一般采用脾结节形成测定法，计数脾脏的结节数一个造血干细胞增殖分

13、化成一个集落，通常植入的造血干细胞数与生成的脾结节数呈线性相关。,造血干细胞移植进展,39,4.鉴定结果,采用造血干细胞表面标志即分化抗原的鉴定造血干细胞。如CD34分子、血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2,又称KDR）CD133（AC133）分子。,造血干细胞移植进展,40,体外细胞的生长过程,体外细胞培养的过程大致分为原代培养期、传代期和衰退期三个阶段。原代培养期： 细胞自体内新鲜组织取出并在体外培养生长至第一次传代的时期，约持续14周。此期细胞活动较活跃,造血干细胞移植进展,41,体外细胞的生长过程,传代期： 原代培养的细胞生长至一定时间后，达到较高密度，此时应将原代细胞接种至其他培

14、养皿中，此过程称为传代。 衰退期： 此期细胞仍在生存，但增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，直至衰退死亡。,造血干细胞移植进展,42,培养细胞的传代生长过程,细胞传一代经历四个阶段： 滞后期 对数生长期 稳定期 衰退期,造血干细胞移植进展,43,滞后期,包括悬浮期和潜伏期。细胞的胞质收缩，包体呈圆球状，悬浮于培养基中。经过一段时间的培养，有活力的细胞开始附着于底物并逐渐延伸，恢复原来的形态，但还不分裂增殖。正常细胞的滞后期约为2496小时。,造血干细胞移植进展,44,对数生长期,细胞增殖旺盛，开始阶段细胞的增长速率与最初细胞数成正比，此时细胞数量呈指数增长。此期持续时间的长短因细胞本身的特性和

15、培养条件而异，一般持续35天。,造血干细胞移植进展,45,稳定期,此期细胞虽仍保持分裂增殖能力，但增殖的细胞数与死亡的细胞数相当，从而处于一种动态平衡的状态。,造血干细胞移植进展,46,衰退期,处于稳定期的细胞如不传代或不加入新的培养基，则会进入衰退期，逐渐死亡。此期死亡细胞数超过分裂细胞数，细胞数因此逐渐减少。,造血干细胞移植进展,47,培养细胞的细胞周期,G1期 发生在上一细胞周期的M期之后，此细胞周期S期之前，有称为细胞分裂后期。在G1期主要发生与DNA合成前有关的生化变化。 S期 此期主要进行DNA的合成，各种细胞的S期持续时间的差别较小，一般为68小时。,造血干细胞移植进展,48,培

16、养细胞的细胞周期,G2期 发生在DNA合成后或细胞分裂前，有称细胞分裂前期。G2期持续时间较短，一般为23小时。 M期 即细胞分裂期。处于分裂期的细胞是评价细胞增殖和生长能力的参考指标。此期持续时间很短，一般只有12小时,造血干细胞移植进展,49,5. 注意事项,污染预防和处理 培养基成分 培养基的酸碱度,造血干细胞移植进展,50,5. 注意事项,另外 接种细胞应处于对数生长状态。处于静止期的细胞在新鲜培养基中开始阶段生长缓慢或根本不生长。,造血干细胞移植进展,51,5. 注意事项,细胞接种前，培养基要预先加热至37，培养基的PH用CO2预先平衡。 细胞的接种密度要大于1105/ml。,造血干

17、细胞移植进展,52,5. 注意事项,搅拌速度在100300r/min的范围内，能够保持细胞处于均匀的悬浮状态即可。 至少每天取样一次，检测细胞的生长状况和计数细胞密度。,造血干细胞移植进展,53,第三部分,临床移植,造血干细胞移植进展,54,1.1 移植的基本概念,对患者进行超大剂量化疗和（或）放疗以摧毁患者的造血和免疫功能，同时最大限度的杀灭肿瘤细胞，然后输入正常供体的造血干细胞或预先采集的患者自体造血干细胞，以重建患者的造血和免疫功能，称为造血干细胞移植技术。,造血干细胞移植进展,55,1.1 移植的基本概念,造血干细胞主要存在于单个核细胞中，表达CD34抗原。CD34+细胞占单个核细胞的

18、1%4%。 大量研究提示，CD34+HSC源于CD34-HSC，即CD34-细胞才是真正的造血干细胞。,造血干细胞移植进展,56,1.2骨髓移植的分类,自体骨髓造血干细胞移植（AHSCT）. 同基因造血干细胞移植,即单卵孪生同胞（identical twin）供髓。,造血干细胞移植进展,57,1.2骨髓移植的分类,异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT），包括：HLA相合或半相合的同胞供髓；HLA相合或部分相合的相关供髓；HLA相合或部分相合的无关供髓。,造血干细胞移植进展,58,1.3骨髓移植前的准备,最重要的是移植 患者的准备,造血干细胞移植进展,59, 系统检查及注意事项,a原发病状况

19、 b心，肺，肝，肾功能 c糖代谢功能 d口腔科检查 此外，应去处隐性感染灶，如耳、鼻、喉、肛周等处的病灶。,造血干细胞移植进展,60, 全环境保护,全环境保护（tTEP）包括口服肠道不吸收抗生素（常用抗生素有黄连素、庆、无菌饮食、皮肤清洁消毒和眼、耳、鼻、口腔、脐、阴道等部位的消毒；住空气层流病房（LAFR）等。,造血干细胞移植进展,61, 全环境保护,TEP的时间应持续1014天左右，其目的是尽量减少患者体内致病菌的负荷，从而最大限度地降低骨髓移植后感染的发生率。,造血干细胞移植进展,62, 移植前预防感染的措施,清除感染灶及体内已存在的病原体，以防预处理激活体内已存在的病原体。 a细菌感染

20、的预防 b真菌感染的预防 c病毒感染的预防,造血干细胞移植进展,63,1.4 供者的选择,骨髓移植供髓者的选择关系到骨髓移植的方法、预处理方案、移植后处理及预后等。,造血干细胞移植进展,64,1.4 供者的选择,供受者之间HLA相合与否直接影响着造血干细胞移植的成败，所以通过HLA的检测来筛选供者。,造血干细胞移植进展,65,1.4 供者的选择,HLA基因系统是人类主要组织相容性复合体。由一系列紧密连锁的基因坐位所组成的HLA系统构成了人体生物学的“身份证”。,造血干细胞移植进展,66,1.4 供者的选择,个体的免疫活性细胞均以HLA作为识别“自己”与“非己”的标志，从而通过免疫反应排除“非己

21、”，保持“自体”的完整性。,造血干细胞移植进展,67,1.5 移植免疫学,现代医学三大支柱： 1、神经生物学：解决生物信息如何传递问题 2、分子免疫学：认识自己和排斥异己的问题 3、分子生物学：研究分子机制的方法和工具,造血干细胞移植进展,68,1.6 骨髓造血干细胞的采集,麻醉 抗凝 采髓前准备 骨髓采集 采髓部位为髂后上棘，多点穿刺，分次采取。 采集的有核细胞数应2108/kg，CD34+细胞应2106/kg。,1.5骨髓造血干细胞的采集,造血干细胞移植进展,69,1.7 预处理,移植前的预处理是指移植前14天到移植时给予患者的化学药物治疗及放射治疗。,造血干细胞移植进展,70,1) 目的

22、,最大限度的消灭患者体内的异常克隆或肿瘤细胞，减少复发； 破坏患者免疫系统，为造血干细胞的植入提供条件，防止排斥反应； 清除异常细胞，为造血干细胞及基质细胞的植入和增殖提供必要的空间。,1) 目的,造血干细胞移植进展,71,1) 目的,最大限度的消灭患者体内的异常克隆或肿瘤细胞，减少复发； 破坏患者免疫系统，为造血干细胞的植入提供条件，防止排斥反应； 清除异常细胞，为造血干细胞及基质细胞的植入和增殖提供必要的空间。,1) 目的,造血干细胞移植进展,72, 用于消除白血病细胞或肿瘤细胞的措施,全身照射（TBI）+化疗 不含TBI的联合化疗,造血干细胞移植进展,73, 抗肿瘤化学药物,几乎所有的抗

23、白血病药物均可用于白血病患者骨髓移植的预处理,造血干细胞移植进展,74, 用于抑制受者免疫功能的药物,a抗淋巴细胞球蛋白（ALG或ATG） b全淋巴结照射（TLI） c最常用药物有环孢菌素(CSA),造血干细胞移植进展,75,1.8 移植并发症,1) 造血和免疫功能受抑 2) 出血性膀胱炎 3) 间质性肺炎,造血干细胞移植进展,76,1.8 移植并发症,4) 肝静脉闭塞病 5) 移植物抗宿主病（GVHD） 和移植排斥反应 6) 晚期并发症,造血干细胞移植进展,77,2骨髓造血干细胞移植的临床应用,血液病 1、血液肿瘤 白血病 2、非血液肿瘤 再生障碍性贫血,2骨髓造血干细胞移植的临床应用,造血干细胞移植进展,78,2骨髓造血干细胞移植的临床应用,非血液病 1、实体瘤 1）乳腺癌 2）小细胞肺癌