流式细胞技术基本原理及应用

1、流式细胞仪基本原理及应用 检测标准化，结果更准确，操作更简单,提 纲,Beckman Coulter 公司介绍 流式细胞技术基本原理 FC500全自动分析型流式细胞仪介绍 Gallios 十色分析型流式细胞仪 流式细胞技术科研应用,Dr. Beckman于1935年创立Beckman公司 Coulter兄弟于1958年创立Coulter公司 1997年两大公司合并为Beckman Coulter 一直致力于为生命科学研究提供全套的解决方案，产品涵盖临床诊断和生物医学的多个领域，包括临床生化、血凝/血球、实验室自动化、离心机、流式细胞产品、基因组学、蛋白质组学、颗粒特性分析等 20多万台仪器设备

2、在全球130多个国家地区的医院和科研院所高效运转 年销售额超40亿美金，被财富杂志评为 “最值得钦佩的公司”之一 名列全球福布斯500强,Beckman Coulter 公司介绍,Beckman Coulter：世界上最主要的高端流式细胞仪技术制造商,贝克曼库尔特细胞组学产品线,Z1/Z2细胞分析计数仪,Vicell 全自动 细胞活力分析系统,4 色数字化分析型流式 Epcis XL,5色数字化分析型流式 FC500,EPICS ALTRA分选,Gallios科研型,MoFlo XDP高端分选,MoFlo Astrios 高端分选,Quanta SC（2007）,临床型Navios,CyAn

3、ADP（科研型）,1990,2005,2009,2009年12月份上市,流式细胞技术基本原理,What is Flow Cytometry？,流式细胞技术(Flow Cytometry,FCM)是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术。 它结合了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。,FCM的技术特点,测量速度快 以单一细胞为分析基础 多参数测量 统计学意义 高分辨率(CV2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度100MESF（Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome），前向角散射光检测

4、灵敏度(0.20.5m) 分选纯度可达99%以上,细胞的相对大小（FSC-Forward Scatter） 细胞的相对颗粒度和内部复杂度（SSC-Side Scatter） 细胞的相对荧光强度,What Can a Flow Cytometer Tell Us About a Cell?,FC500流式细胞仪的检测范围,细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体,流式细胞仪是细胞组学的定量工具,可以做以下定量： 细胞相对定量（） 细胞绝对定

5、量（细胞/l） 细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞） 可溶性蛋白绝对定量（g/ml）,荣获国际工业设计大奖和质量最高奖，得到国际公认 获得FDA和中国SDA认证，安全性和结果可靠性得到肯定,全自动5色流式细胞仪Cytomics FC500 Flow Cytometer,先进的光路设计 高分辨20Bit数字化电子系统 丰富灵活的进样系统 基于Windows界面的高度人性化软件,FC500 Flow cytometry的基本结构,流路： 流动室 鞘液 sheath 样本流 sample 光路： 光源 光学收集系统 电路： 光电倍增管(PMT)、光电二极管、 放大器（线性、对数） A/D 转换（光信

6、号转换为电信号之后的处理分析 道数和电信号的脉冲转换 ） 统计：计算机 软件,流 路,流动室,侧向及荧光信号,前向散射光信号,鞘液,激光,样品管、鞘液管和流动室等,由于鞘液的作用，待测细胞被限制在液流的轴线上流体动力学聚焦,FC500的光源和光路,先进的单激光激发5色系统,单激光 就能激发5色荧光 20mW 488 nm Blue air-cooled argon (氩离子激光),单激光同时激发5色荧光，确保信号来源于同一个细胞，结果准确可靠,其它公司同档机器单激光只能激发4色，第5色需要安装第二根激光激发。由于有两个检测点，在鞘液压力变化、样品浓度、样品大小不均、转换采样速度时不能确保信号来

7、源于同一个细胞而是两个细胞，信号收集发生错误,双激光排列方式：共线性排列（只有一个检测点）,FC500的光源和光路,双激光共线性：,信号来源于一个检测点,散射光测量原理,散射光的性质,波长与入射光一致，为细胞固有的物理及生理特性，可依此对未染色的细胞进行分析 - 前向散射光(FSC):与细胞大小有关- 侧向散射光(SSC):与细胞内部的结构及颗粒性有关。,FC500 提供两种检测角度的前向角散射光，更好通过大小区分不同细胞,荧光信号检测原理,ATOM,荧光素及荧光发生机理简介,FITC荧光素的激发和发射光谱,每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发

8、射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号,FC500流式常用荧光染料,荧光素的使用： 选择正确的激光器 确定正确的滤光片 确定所需荧光探测器（PMT）,光学系统：滤光片（Filter）,荧光激发波长根据所选的荧光素而异，可通过一组不同的光学滤片传递到各个PMT(光电倍增管中),FC500 的光路固定光路，互换式滤片,矩形反射光路，光路短，能量损失小，易于低强度荧光检测，并且组合滤片能保证荧光检测的特异性 完全光学线路免校正 客户可自由更换的滤片组合，且无须校正光路，可方便新荧光染料的使用，扩展机器的功能；,流式细胞仪的电路,进行信号检测和分析 荧光信号由光电接收器（PMT

9、）接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析,光电管和检测系统： PMT,光电管和检测系统：放大器,基本原则 - 信号强弱差10倍or需分析弱荧光:使用对数放大器(如荧光),FC500 采用20比特的信息量数字化信号采集分析数据数据信息量和检测精度的对应关系,3 Shapiro, H. Practical Flow Cytometry, 4th Ed. Page 206.*LSB = least significant bit, voltage difference between channel

10、n and channel n+1.,The table shows the attributes of analog to digital converters3. Based on the number of bits, the input signal (or voltage) must increase by this amount in order to affect a change in the channel displayed.,FC500,Sample data On 20bit FC500,10MB/sec光纤传输信号，反应迅速 荧光分辨率的解析度更高，细胞分群更好 在荧

11、光表达低通道处（100-101阴性细胞位置）不会出现低分辨率数据常见的信号不饱和现象,220 = 1,048,576 channels,218 = 262,144 channels,Sample data On other 18bit Analyzer,FC500 优秀的荧光检测灵敏度和分辨率,C Analyzer NONE smooth histogram CD19 FITC NO WASH,FC500 NONE smooth histogram CD19 FITC NO WASH,同一份样本检测，FC500的信噪比更好,FC500 Flow cytometr的基本结构,流路： 流动室 鞘液

12、 sheath 样本流 sample 光路： 光源 光学收集系统 电路： 光电倍增管(PMT)、光电二极管、 放大器（线性、对数） A/D 转换（光信号转换为电信号之后的处理分析 道数和电信号的脉冲转换 ） 统计：计算机 软件,FC500 高度自动化人性化的软件系统,Windows 2000系统平台 多用户操作 可以将每天的应用预先设置和安排 FCS 3.0 文件格式，可以直接打开 多种结果输出形式，完全与OFFICE兼容 多种图形叠加方式 开放式软件，可以在任何电脑上安装使用,Quickset直观的电压调节,QuickComp直观的补偿调节,补偿前,补偿后,FC500 丰富的上样系统高通量标

13、准化自动化,32 支试管自动上样盘（MCL) 独立获取样本简单，自动检测和报告，有利于实验的标准化，减少人为误差 每支试管检测前单独震动混匀，有利于均匀获取细胞，结果更准确可靠,FC500 配套自动化标本处理系统,全自动标本处理和溶血系统，灵活搭配，减少人为误差，节省人力和试剂 Q-PREP TQ-PREP PREPLUS II,标本处理系统上样装置与FC 500 完全兼容,FC500 全自动无缝连接的流水线系统,无人值守 标准化操作 杜绝污染 速度快,模式一,模式二,独家的可升级多平台自动上样系统,FC500 MPL 24 孔 96 标准孔和深孔反应板 40 支试管 (12x75mm) 可以

14、固定体积上样检测,可以减少高通量工作需要的烦杂的取样过程 将您的注意力从操作中解放出来，而集中于思路的 创新,FC500是一款单平台既能96孔板又能40管常用试管上样的流式细胞仪,FC500 智能化的体现,FC 500 面板LED显示屏能随时自动显示 各色荧光的强弱， 激光开启状态， 上样速度， 鞘液、废液水平,FC500 特点,1 根激光5色荧光分析，获取高可信度多色数据 2 种角度前向散射光检测功能，更准确定位目的细胞, 20Bit高分辨电子系统，更精确解读荧光信号 3 种图形显示及更强大的分析工具：各种2维平面图，三 维立体图， 独特的PRISM 浓缩柱形图，无限制的直方 图叠加功能 4

15、 种进样方式：单一试管，32管自动上样，24/96 微孔板，40管自动上样，具有目前最丰富的进样模式 5 5X5 ADC正反全矩阵高精度补偿及离线补偿系统，自 动化的电压补偿调节功能，强大的批量处理分析功能,检测的一般步骤,设置检测方案（PROTOCOL) 染色标本（同型对照，补偿管，待测样本） 同型对照管调电压 电压不变，补偿管调补偿 电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果,电压调节利用同型对照：设置背景,电压 volts 增益 Gain,设定阴性和阳性信号强度的临界点,荧光补偿,FITC,PE,受激光照射后FITC和PE分子发射光谱相互干扰,荧光补偿的调节,QuickComp直观的

16、补偿调节,补偿前,补偿后,补偿调节利用单标样本，来消除荧光交叉,原则： 单管单色标记交叉调节,确认电压,单标记管自动计算CROSSOVER,验证管,补偿调节-最精确的全矩阵软件,利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道之间都可以进行补偿）,数据分析,Dot Plot（双参数点图） Histogram（单参数直方图） Region（门） Statistics（统计结果）,参数,50,Gallios,最新产品 多种专利技术和优化设计 全球用户的一致认可，全球销售逾千台 真正支持当前流式发展趋势 多参数（几十个） 小颗粒检测 弱荧光表达 稀有细胞 自动化高通量上样,全自动十色Gallios流

17、式细胞分析系统,激光器的独特设计,创新的卡槽式设计 微马达自动固定激光，真正固定光路，无需调整维护，即开即用 灵活开放的平台，用户可自行升级更换新波长的激光，如561nm、375nm，保证未来的应用不受限 每根激光有单独开关，延长激光使用寿命,51,多色的灵活配置,405nm,638nm,488nm,2 Lasers 6 colors (5+1) 2 Lasers 8 colors (5+3) 3 Lasers 10 colors (5+3+2),多色检测优势,观察混合样本中不同细胞亚群之间的数量变化和功能联系 减少批次操作的变异误差 准确识别细胞亚群以及评价细胞功能 提高检测效率 节约珍贵稀

18、有样本 增加灵敏度和分辨率,光胶耦合石英杯提高光收集效率77%,利用光纤高效传输荧光到PMT,18o 全反射收集光路减少光损失,The Boulevard,高效的光收集系统 保证多色分析的荧光灵敏度,紧凑式设计缩短光信号传输距离 光损失最小的反射角度 用户自由插拔式光学滤片，更换后无需调节光路，保证新染料和应用不受限,独家提供仪器内部温控,确保仪器始终处于工程师安装调试时的最佳状态 保证实验准确性和重复性,平均荧光强度变化在2%以内,Gallios,平均荧光强度变化超过25%,没有温控的仪器,FSC W2,SSC,FSC W2,W2 可应用于血小板微颗粒，内皮微颗粒，红细胞微泡，以及细菌的检测

19、,独有的多角度前向角散射光检测功能,FSC对于流式检测至关重要，影响圈门和统计 针对不同类型样本，独家提供三种前向角散射光检测角度 1-8低角度：适用于分辨8-40um的颗粒 1-19宽角度：适用于分辨0.5-10um的颗粒 W2 增宽型大角度：相差0.1um的细胞颗粒以及背景噪音区分开,微颗粒（microparticles，MPs）,近年研究热点之一 微颗粒是细胞激活或凋亡时从质膜脱落的一些膜性小囊泡，有促凝、促炎症和调节内皮功能的作用 研究表明，微颗粒与血管生成的关系密切，在高血压、糖尿病、缺血性疾病以及肿瘤的发展中发挥了重要作用 微颗粒水平增加见于多种疾病，如血栓症（血小板微颗粒）、充血

20、性心力衰竭（内皮微颗粒）、妇女先兆子痫（合胞体滋养层细胞微颗粒）,微颗粒（microparticles，MPs）,真实有效的分析速度和信号处理能力,40MHz 数字化采样频率 最大上样速度25000个细胞/秒（90%产率），大大节省检测时间和宝贵样本 可检测高度、面积、宽度、时间、比率参数,Gallios,Other Cytometer,Data Rate,%Yield,Sample data On 20bit Gallios,10MB/sec光纤传输信号，反应迅速 荧光分辨率的解析度更高：20比特 细胞分群更好， 检测、圈门和统计更准确，尤其适于分析分选含量稀有、微弱荧光表达差异或荧光连续表

21、达的细胞群体,220 = 1,048,576 channels,218 = 262,144 channels,数据分辨率和信号精度最高,Sample data On other 18bit Analyzer, Queen Mary, University of London 2005,R：阳性细胞数 N：需要获取的细胞总数 P：阳性率 CV：变异系数,单个样本处理和储存信息量：2400万细胞,科学试验要求良好的准确性和重复性，统计上一般要求平行试验的数据结果的变异系数CV5，流式细胞仪单次上样处理和保存数据信息量要求更高，以便精确圈定分析分选区域 尤其适合低含量稀有细胞群体（树突细胞、抗原特异

22、性T细胞、Treg、各种干细胞、各种实体组织来源细胞等）， 轻松实现万分之一以下含量的细胞检测,不同含量目的细胞需要获取的细胞总数,自动或手动模式，无需机械式安装调试 单管进样或32管连续进样（88管/小时），真正实现Walkaway 每支试管检测前单管震动混匀功能，避免整盘振荡多次混匀对细胞形态、完整性和活性的影响 全方位的条码扫描识别功能（转盘号、管号、单管条形码），方便高通量大样本信息录入 可随时暂停 / 旋转以方便添加刺激剂等 样本间自动清洗，交叉污染0.1% 最小死体积20ul 减少操作者和样本接触(生物安全),轮盘式高通量标准化自动化上样系统,长效稳定供液设计支持长时间样本分析,液

23、流车系统 外接大容量鞘液桶不间断补液，保证内置鞘液盒液面恒定，消除液面下降引起系统压力变化对检测的影响 外接大容量废液桶 内置清洗液桶,定时自动开关机、清洗维护及远程诊断功能,简单直观的应用方式,实时补偿/脱机补偿/自动补偿,PRISM 浓缩柱形图真正支持多色分析,一张图上显示多达1024个表型组合结果（十色分析，210分析组合） 将实验所分析的所有细胞数据结果简单地浓缩在一张直方图上 能直接读出各种阴性或阳性组合的结果 清晰直观且便于数据的保存,支持最全面的生命科学研究内容,细胞生理功能研究（死活鉴定、细胞内pH值、细胞内钙流、膜电位、酶活性） 免疫功能研究（包括淋巴细胞亚群分析、细胞绝对计

24、数、细胞活化、细胞因子、调节性T细胞、树突细胞、抗原特异性T细胞、Th17细胞等） 造血干细胞计数 血小板疾病及活化血小板检测 HLA-B27强制性脊柱炎筛查 白血病及淋巴瘤免疫分型、残留白血病检测 器官移植的配型及免疫状态监控 AIDS诊断及治疗监控 肿瘤相关研究（肿瘤相关基因表达、抗肿瘤药物作用机制及多药耐药、放化疗以及生物治疗疗效的研究、循环中肿瘤细胞等） 药物筛选，抗体研发，疫苗评估 干细胞研究（干细胞的分离、鉴定、功能分析等） 细胞周期和DNA倍体分析、DNA含量测定、细胞周期蛋白 细胞凋亡及凋亡相关蛋白 磷酸化蛋白的检测及信号传导通路的研究 细胞治疗,流式细胞仪应用举例,一、稳定细

25、胞株的筛选,GFP转染后转染细胞（蓝色）与 空载体转染细胞（红色）的对比， 转染效率73,1、靶基因转染至目的细胞 2、检测报告基因-荧光蛋白 （GFP,YFP,Dsred）转染效率 3、阳性细胞的无菌分选,二、细胞周期/DNA含量的分析,常用染料： PI 7-AAD Hochest33342,G0/G1,S,G2/M,肿瘤细胞判断标准： DNA指数 大于1.1或小于0.9 S期比例大于15% S+G2期比例大于20%,对抗肿瘤药物机制及疗效评价,分析单细胞群体，去除粘连细胞,FS,SS,A,W,A,H,利用脉冲高度，面积，宽度三参数去除粘连细胞,细胞周期分析 / DNA含量分析,第三方软件分

26、析周期 Multicycle，ModFit等等,决定cell cycles数 排除细胞碎片（debris） 执行分析 分析数据 信赖度分析 （Confidence analysis） 可信区间 六种信赖度模式总结,DNA与蛋白同时检测,Anti-Cyclin A2-FITC,7-AAD,对照,Thapsigargin,Paclitaxel,G0 39%,M 1.5%,G0 5.3%,M 62%,G0 28%,M 1.2%,Cell proliferation,CFSE在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。 Brdu是5-溴脱氧尿嘧啶核苷代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，同时结合PI/7AAD双重染色.,