分子生物学-10-3-第五章基因文库1-概念和步骤

1、教学内容与教学设计：（续上节）绝大多数基因难以直接分离得到高等真核生物，基因组DNA十分庞大基因可达数万个基因组成结构复杂 编码序列、非编码序列、调控序列、间隔序列、重复序列单个目的基因在整个基因组中所占比例极小未知基因更难克隆 要分离的目的基因往往是未知基因 无法对它进行特异性扩增， 只能对所有的基因进行扩增，构建基因文库 然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来 最后分离得到目的基因。5.2.5 基因文库1、概念 又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落(或噬菌体)的集

2、合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。基因文库包括基因组DNA文库和cDNA文库1. 基因组DNA文库(genomic DNA library)：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库 从特定组织提取的染色体基因组DNA，其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因，研究基因组成2. cDNA文库(cDNA library)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cD

3、NA信息，总称cDNA文库 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。 从特定组织mRNA反转录成的cDNA拷贝，其目的是分离某一特定器官在特定发育时期细胞内的mRNA，研究基因表达2、基因文库构建的一般程序3、基因组DNA文库的类型1. 质粒文库2. 噬菌体文库3. 粘粒文库4. 人工染色体文库 （细菌人工染色体文库、 酵母人工染色体文库）人工染色体载体l 人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统，包括YAC、BAC、PAC、MAC和HAEC。l 染色体基本功能单位包括复制起始点(replication origin)、着丝粒(centromere)和端粒(telomere)。复制起始点，保证

4、了染色体复制，着丝粒保证了染色体分离，端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在。l BAC和PAC是用于原核生物大肠杆菌内的人工染色体。l BAC是以细菌大肠杆菌F因子(fetility factor)为基础构建的环形质粒，容量为300kb，l PAC则以P1噬菌体(P1 phage)和F因子为基础构建的环形质粒，容量为130-150kb。它们不是严格意义上的人工染色体，因为它们不含着丝粒和端粒。l YAC是酵母人工染色体，它含有着丝粒，复制原点和端粒，能稳定遗传，其容量在100-2000kb。在染色体区带构建YAC重叠群，促进了大规模基因组测序和致病基因的克隆。 l

5、 MAC哺乳动物染色体基本功能单位。如果研究成功，可能成为很好的基因治疗载体和转基因动物载体。l HAEC是基于人类EB病毒而构建的环形DNA，含有EB病毒的复制原点(oriP)和潮霉素抗性基因。能以环形小染色体形式复制，并在有丝分裂中保持稳定。HAEC可能会成为基因治疗的重要载体。 4、基因组DNA文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：1. 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力2. 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆3. 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序4. 克隆片段易于从载体分子上完整卸载5. 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选

6、等后续操作5、计算文库规模的公式 计算完全基因文库所需实际克隆数的公式N=ln(1-p)/ln(1-f) 式中，N是 所需克隆数；P为重组体群体中出现目的基因序列的几率；f为限制片段的平均大小与基因组DNA总量之比。例：大肠杆菌基因组大小为4.6106bp,所克隆基因组DNA片段的大小为2 104bp，为使目的基因存在库中的概率为99%，该基因文库含有重组体克隆数应大于多少？ 解：N=ln (1-99%) / ln 1-(2 104bp/ 4.6106bp)=1.1 1036、基因组DNA文库构建的程序 载体DNA的制备； 高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备； 高纯度大相对分

7、子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离； 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； 重组克隆的挑选和保存。7、基因组DNA文库的保存1. 滤膜影印保存法-已经不常用2. 文库在液体培养基中扩增保存l 方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）l 缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致 文库中某些特定的序列过多或过少3. 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中l 方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70 oC或-25 oC

8、下保存。l 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大8、基因组DNA文库的筛选1. 表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选2. 抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄 二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长3. 分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选4. 免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选5. PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段5.3 RNA操作与 cDNA文库构建1、cDNA文库的特点1. 有基因特异性 常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：15% mRNA，8085% rRNA，1015% tRNA2.

9、有器官特异性 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同3. 代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同4. 不均匀性 在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。5. 可表达性 各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）2、cDNA基因文库构建的步骤1. 细胞总RNA的提取2. mRNA的分离和纯化 3. 第一条cDNA合成4. 第二条cDNA

10、合成5. 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体6. 导入宿主中繁殖5.2.3 Polymerase Chain Reaction, PCR1、定义聚合酶链式反应（PCR），是一种在体外（in vitro）短时间内大量、迅速的选择扩增特定的靶DNA序列的核酸扩增方法。PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。 PCR三步曲 变性 9097 退火 4555 延伸 72左右2、几个关键点1. 第一周期中，合成

11、的每一条新生链都超出了另一个引物的位置；2. 在第二个周期中，以第一周期中合成的DNA为模板合成的DNA位于两引物位置之间，这就是所需扩增的特异DNA片段；3. 在第三个周期中，经过同样的变性、复性、延伸步骤进行扩增，以第二轮中的新生链为模板，就形成特异DNA双链，4. 以后每增加一轮，它扩增一倍，是指数扩增3、PCR产物的积累规律 DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。 反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n），随着目的DNA的积累，在引物模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和平台期 。4、PCR的主要用途1. 目的基因的克隆PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的

12、有效方法之一。主要采用的方法有：l 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA 获得已知目的基因片段；l 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因；l 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段；l 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。 2. 基因的体外突变l 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。3. DNA和RNA的微量分析l 由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析检测。 4. DNA序列测定5. 基因突变分析5、反转录PCR1. 定义：RT-PCR是指利用反转录酶将R

13、NA反转录(RT)成cDNA(Complementary DNA)，然后以cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段的技术。用于在RNA水平检测基因表达的情况。克隆特定基因的cDNA序列和检测RNA病毒。2. 两种选择l 一步法RT-PCR:使用基因特异性的下游扩增引物引导cDNA第一链的合成，因此，从单一样品中仅能特异地反转录出单一信息。l 两步RT-PCR法:可以使用oligo(dT) 或随机引物引导cDNA第一链的合成，因此，可以从一个特定的样品中反转录出所有的mRNA 的信息。此外，两步法可将反转录产物分别进行多重不同的PCR反应，因而可以从一个样品解答多个问题。3. 两

14、种常用的反转录酶 AMV 反转录酶从Avian Myeloblastosis Virus (鸟类成髓细胞白血病病毒)中分离出来的，它拥有双重活性：1. 5-3依赖引物的聚合酶活性，可以以RNA或DNA作为模板；2. 具有3-5 RNase H 活性，可以降解RNA/DNA杂合体中的RNA，它需要Mg2+或Mn2+激活。它可用于双脱氧法测定DNA或RNA的序列和以短的RNA为模板合成cDNA。 M-MLV反转录酶从Moloney Murine Leukemia Virus (莫洛尼氏鼠白血病病毒) 从E.coli菌株提取出来，此菌株含有一个克隆有M-MLV RT基因的质粒，M-MLV基因被删去了

15、RNase H 核心部分。M-MuLV Rtase是一个依赖RNA的DNA聚合酶，在引物存在的条件下，可以以单链的RNA或DNA为模板合成互补DNA链，它缺少RNAse H 活性。 AMV 反转录酶和 M-MLV反转录酶的应用1. RT-PCR 和cDNA合成；2. RNA测序和双脱氧法测DNA序列；3. 引物延伸和DNA片段3-末端的标记。4. 反转录和合成cDNA的第一条链；4. 高特异性Taq酶:热启动Taq酶热启动Taq酶是在常规Taq酶的基础上进行了化学修饰，使得该酶在低温或常温下没有酶活，因此在加样至PCR扩增前，不会产生由于引物随机粘连而形成的非特异性扩增。高温条件下，化学修饰集

16、团会被剪切，从而释放酶活，这就大大提高了PCR扩增的特异性。6、real time PCR1. 荧光定量 PCR（real-time PCR) FQ-PCR 是融汇了PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团)，结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术。通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件，通过分析荧光强度来计算待测样品的初始模板量简单来说：实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。 实时定量 PCR 可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。2. 荧光标记方法 内掺式染料 SYBR Green I（结合到模板DNA小沟）在一定循环数内，根据产物的荧光强度的量来计算出起始模板的量 序列特异性探针Taqman （结合到DNA模板中间）Molecular Beacons分子信标Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)3. 注意事项为了获取未知起始量的待测样品的含量的试验