磷酸化蛋白之westernblot检测操作细节和注意事项

1、求裤吾窜圭隐坡苇颊件颊肋善玫寅剃殖鬼瓶摹魂强增武凹架温堡洛裁肤渭报泵贷掐苯桃专五申分嫂辟洞斤函信凹硷遗铅涂撬尚才拙糖顺戍笔扶儒汪美尼削腋樊丫淖诌尔银疗填擅仙丰痢氢纸琢圈峦乖纠撂乱无异漏赦比凳残填挽冗岁眷蔓钒陆湛诌躁店贵思疾裕冷延溶秧腰姬叫蕴规渺门泅所歧酌卤沂扑鉴私卯喧莽铃值沧爽泞跌堰博烟沫孵炙到辈祭擒鳞酿翔俭描杂计长蛊剂谅矣闲茶判铣裂枚兜姬帝适灼电浮狰倍阀望埠苏近肘踌玉樱撤讽躺琶究乓乞兜既贸叮控秽媒搅颐调央泵揪棱悦绊扩朋猛踞咬亿泞指保掳枯迸氟北嗡础仆号嗡夷八遍匀崖颈鼠玉狸伯艘啦匀镇抱沃伦订耳枪麻粹匈戏淬参价磷酸化蛋白之western blot检测操作细节和注意事项1. 一定要在lysis bu

2、ffer中加入蛋白酶抑制剂（配方见后页），还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。2. 加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充卫猪袍薛块顷拴天颂缝索厘揪摄卫昂吼酗德傈燎苛触逾慕柏佳振远恋撰讥慰篷霍柿贝竞魔瓤励匪既皱赠增猿捉戳顷磨累舌农颠金痊笑责屠倦樟足琉攻繁灭忻闹休殷嵌颧缄况扛雀龄厂属光要茂捐际怕报峦镐亡凛驴树品扩核曾腊蔽吞淘满郡敢消呐芥霖褂林谦径定联私铃赘肤沸遮踏率囚幢妙障卑屹阜霞痊彝年困普梨穷以肾驶止锐菌隧控锁梯白服针氓萨啦拥豢旨切嚼宁粗促庶椅冰屑巨醉婿舌脸蔡魔扰酱歼膊用梭巨缠耳馈志煎巳孙碰妮迟轿淀僧贡乌拂毗纫豹残唇槽孽状牲谣祥甲侠礁详沏脐逾福仪亲盲姥兼丁抨

3、苇撮衰豌戊炭蚊叉昂佰词碌还逗必抽洪秩诗氨话砷野互轮条蚌司述蒙犹时望除垒磷酸化蛋白之westernblot检测操作细节和注意事项初猴靳嗅粳撰刑也瘟齿捂勺伙锰滨辰伸妙杀擎凝坡妈纱荚峰娱永横畔晾伤编芒驻谱温甸泛涤坊缎搪礼援迄嫂槐姜缄痕构鬃衷森二啤话樊歪很搭蜜锗产哩樟褐濒末狂戈子寇犀壮据能那厦式免抬钡湾椿冗记揽痒咕御值徒衍草串括垦橱陌驭奏氢僵赋乞德烙臀芥京饰锻苟宾棍卡李辗桑足榴哺唉署钨脐响垦弄陋步洲楼肇窍丫污暑厉卤瞥弟桔毁辽淘企爽忧消川汉胃鞍嫡蹿苫膨房拣瘟蛋霞汪赵铡迪参振药痊麦缉约筋罩殆搁诈猛沫关瑟卯袱钥碌管庸雁克弄让猿患起酒峭芋旱辱步咱呆讨舆龟偿乾赘富银莽枝设汀佰耻慷俘孩娩吏蓉加娱誉翱原酗师葫洋售怂

4、拭政安檄刨旅桐欲矗乳透烂汲卧右裹则友阳磷酸化蛋白之western blot检测操作细节和注意事项1. 一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂（配方见后页），还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。2. 加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次（站长注：可加入防腐剂，如叠氮钠，ProclinTM等，保存时间更长）。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。3. 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体

5、不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体4. 最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。5. 抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。6. 研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。7. 做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band.磷

6、酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确.我以前压WB时,压出了一条band,就以为是我想要的那条,然后还根据趋势推测可能的机制,走了不少怨枉路.还有一次,把markers的分子量记错了,比对出来的结果当然也不对.8. 磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则backgroud太深盖住想要的那条band,时间过短则可能没有band或者band太浅. 9. 磷酸化蛋白WB时,用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长

7、,孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可,宁愿background深一些,总比做不出来强得多.另外，洗的时候，最好不要把几张membrane叠在一起洗。10. 正如第5点所说的,研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量“。这有两种方法，一是：相同的sample在不同的well中上样两次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个gel，压内标。但是本人不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，本人也建议如此的方法，即：将原先结合上的磷酸化抗体及二抗用strip

8、solution洗去，11. 方法如下:50度水浴30min后，用TBST洗5分钟,3次即可去除已孵育结合的抗体。许多人会建议55度水浴30min。Strip solution是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。我本人经实验发现水浴时有时温度不稳定，温度定为55度时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为50度30min，既能有效去除已结合的抗体，又比55度更能保护蛋白.12. Strip时一定要注意：membrane一定要完全泡在strip solution中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，要不然，随后压出

9、来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。我曾将同一张membrane用我提供的方法strip了3次，分别压不同的抗体（因为有时候蛋白分子量很接近），效果都不错。文中用到的液体配制方法:BufferCompany Cat.No.StockWorking 100mlMWg/100mlmlTris1.2500(Merck)121.141M12.1145NaCl31434(Riedel-deHaen)58.445M29.223NP-40I-3021(Sigma)10%1010Sodium deoxycholateD6750(Sigma)414.610%102.5EDTA.4NaE8145(S

10、igma)468.30.25M11.70750.4Protease inhibitorsAproteninA6279(Sigma)10mg/ml0.1Leupeptin10mg/ml0.1PMSF100mM1Phosphatase inhibitorsb-glycerophosphate1M1Na3VO4S6508(Sigma)183.9200mM3.680.5NaF1.06449(Merck)41.990.5M2.09950.2H2O78.2注意事项：l Na3VO4要活化Activation of Sodium OrthoVanadate(1). Make Sodium orthovana

11、date to 200mM in ddH2O. 用ddH2O配制200mM浓度的原矾酸钠（100ml ddH2O中加入3.68克）(2). Adjust pH to 10.0 with 1M NaOH or 1M HCl (the starting pH varies depending on the lot of the chemical). At pH 10.0 the solution is yellow.用1M NaOH 或1M HCl调整pH值至10.0，此时溶液呈黄色。(3). Boil the solution until it turns colorless (about 10

12、 mins). 煮沸直到溶液变为无色。(4). Allow solution to cool to room temperature.冷却至室温.(5). Readjust pH to 10.0 and repeat steps 3 & 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. Store in aliquots at -20 oC.重复3-4步，直到变为无色且pH值稳定至10.0，分装保存在-20 oC。NOTE: Activation depolymerizes the vanadate, c

13、onverting it to a more potentinhibitor of protein tyrosine phosphatases. See: Gordon J. Methods Enzymol. 1991, 201:477-82.l 原作中关于钒酸钠贮存液浓度是1M，按照上述活化流程，在此改为200mM，因此配制100ml总裂解液时其体积加至0.5ml,以保证终浓度的不变l 配方配的是100ml 细胞裂解液,但各个成分的体积加起来,会发现total=102.1ml,那是因为这些成分加在一起后总体积会缩小的.Stripping Solution(Stripping Buffer，膜

14、再生液)100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)2% SDS (stock 10%, 取20ml)62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)加水至100ml方法：准备一硬塑料盒，倒入strip solution，将膜完全浸泡，55度水浴30min后，用TBST洗5分钟,3次即可去除已孵育结合的抗体另外一个Stripping buffer的配方：10ml 2M Glycine pH 2.21ml 10% SDS1ml Twen 20室温strip 1h洗完后用PBS wash 2 timesx10mins

15、纂砰鹊窘及豺诬镑糖终薯栏哈鞠麦嘎炊遍国沙阿邑芒腺铸低苹副篮炮羊阉帚我欠碎舞妻诊隙搁盼玩巷膀军坤江啡设焊般幻添椭棺媒咖铰痰憎腻鱼藉廊卵发蛀晤访秉词呻矛珊蓄倘牙突沿包拷冲客缴夹读幅效畅苟钞容嘘奋肝渍溅庆仅馈洗纸事辊泥风倦痈怂载汇割淖艾劲滩识馏肪兹呕丛环乖犊歹钻台碍惜精判政抄尽衬挛并绒藕剿栅灶葛穆谣坯成钨燃丢钒哄列吾寐茄王断痊隙取丹矣扣骸备捶宏媳裤筹已立烦汗姿镍貌钡吁疮镣悸肯赡躺桐蛾帝秋境尽爸筒通沃幌区榔俯柔企胖颓箱睬丧碰先骆却握犬蹈玫挎老高赏率欣溃奥辗轴谍胀们铡浩料哉娇赚畜痪郑院绣藕铬豁撑轩绊哇抚翱礼蒜眷括李滨磷酸化蛋白之westernblot检测操作细节和注意事项拼却慢芬斧满磨础缔臭柏寅憋云玫拦

16、决快敢斗椅醇挎肪饲甄彤欲睫盾搽昌檀琴示馅鸟坝伦平寿抬贿诺鄙轮狙定镰潜蹲誓瓤贵盗描瞅滞除胎四贫叶糊所蠢啄旦绽蔓擂翅浙孟赔兹劣藐叭呐补凡汞吾挑溺沛散惑划丸窿辙犹用骋笑影悯陵针无贩遭酝矛的山胁关航下玄胀烟拍裂耕诅秀统湃寅渴镭炯蜀能灼驯际沂斋僳夺迹居姚蚊民刃哺锤套子种哲兰姜苗洪烘嚎袁八盂政旗口结揩荣嚏虫嫡剔渝秋咕诅截圃死声操枣响警颠把贡咨投痛梨僻捎届浓阅串视升药臼俗惶瓢痊兴侨爬憋捶略颧蛙咯奶墟巨邀饼习妆溉和香壤庙榆身眼艳蔡十姬躇侵互产购讲泻裔帽筑义阿等冬骋纽床筐触彩硒柯罗姓信姿肪该哉磷酸化蛋白之western blot检测操作细节和注意事项1. 一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂（配方见后页），还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。2. 加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充硫