铵态氮(靛酚蓝比色法)

1、铵态氮（靛酚蓝比色法）方法与原理：土壤浸出液中的NH4+在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝,溶液的蓝色很稳定，在NH4+-N浓度为0.050.5mg.L-1范围内，其深浅与NH4+-N含量呈正比.试剂：1. 酚溶液：10g苯酚和100mg(0.1g)硝普钠（剧毒）【Na2Fe(CN)52H2O】1L水 暗瓶存于4冰箱2. 次氯酸钠碱性溶液：10gNaOH,7.06gNa2HPO47H2O,31.8g Na3PO412H2O和10 ml次氯酸钠【w(NaOCl)=5.25%】1L水中 暗瓶存于4冰箱3. 掩蔽剂:酒石酸钾钠溶液【（KNaC4H4O64H2O）】=400 g.

2、l-1与EDTA二钠盐溶液【C10H14O8N2Na2】100 g.l-1等体积混合.每 100 ml混合液加入0.5 mlNaOH溶液（10mol/L）,即得清亮的掩蔽剂酒石酸钾钠【KNaC4H4O64H2O】400gEDTA二钠盐【C10H14O8N2Na22H2O】110.7 g稀释至2L. 每 100 ml混合液加入0.5 mlNaOH溶液（10mol/L）,即得清亮的掩蔽剂4. 【（NaOH）】=10 mol.l-1 ： 400g NaOH用蒸馏水定容至1L5. NH4+-N标准液：0.4717g烘干的（NH4）2SO41L水中(定容) 此为NH4+-N贮备标准液。测定当天将此液用蒸

3、馏水水准确稀释20倍（如5ml稀释至100ml） 即为NH4+-N标准液【（NH4+-N）=5 mg.l-1】操作步骤：1土壤30g 置于150ml三角瓶中加入100 ml 2M KCl浸提，振荡(140rpm)30min 过滤（约30ml以上滤液） 210 ml样液于50ml容量瓶+约20 ml水+5 ml酚+5 ml NaOCl 摇匀，在20左右置1小时1ml掩蔽剂以溶解沉淀物 定容50 ml =625nm 比色30/0.5/1/2/3/4/5ml NH4+-N标准液于50ml容量瓶+10 ml KCl+约20 ml水+5 ml酚+5 ml NaOCl 摇匀，在20左右置1小时后加入1ml

4、掩蔽剂以溶解沉淀物 定容50 ml =625nm 比色注意事项:掩蔽剂应在显色后加入，加入过早，会使显色很慢。加入过晚，易生成氢氧化物沉淀可能老化而不易分解，20左右置1小时即可加入掩蔽剂0 ml 0.5 ml 1 ml 2 ml 3ml 4 ml 5ml0 mg.L-1 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5计算结果：*V*ts*10-3 W（N）=m*1000W（N）-土壤中铵态氮（NH4+-N）的质量分数，mg.kg-1-从工作曲线中查的显色液中氮的浓度，mg.l-1V-显色液体积，ml（50 ml容量瓶）ts-分取倍数（100/10）10-3-将ml换算成L的系数m-土壤质量

5、，g1000-换算成每kg土含量实验内容四：土壤微生物DNA的提取 及鉴定（8学 时）1 称土样约0.3g于2ml离心管中，加入1.5ml溶菌酶液（解冻2小时，夏天），混合均匀，并在37水浴锅中放置1h，每10min轻轻的摇匀一次，上下颠倒30下左右（拿出pro-k解冻）2 接着在液氮中放置4min（或高速振荡器6000rpm，45s）和65水浴锅中放置3min，循环3次3 冷却至室温后，加入15ul pro-k（分装20ul，应先在振荡器振荡一下，再short一下）和75ul 10% SDS，55-60下培养1h，6000rpm离心5min4 切掉枪头的tip尖端，提取上清液于10ml的离心

6、管中，沉淀再用0.5ml溶菌酶液和0.5ml 0.5% SDS洗涤一次，6000rpm离心5min，提取上清液（0.5ml 0.5% SDS=25ul 10% SDS+475ul纯水）5 然后往离心管中加入等体积（约2.5ml）tris-饱和酚抽提一次，12000rpm离心10min，提上清液6 加入等体积tris-饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提一次，12000rpm离心10min，提上清液7 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提两次，12000rpm离心10min，提上清液8 将上清液分装于2-3管2ml离心管中，分别加入0.25倍体积的3M乙酸钠，2倍体积的无水乙醇，于-20过夜沉淀9 然后在室温下12000rpm离心10min，去上液10. 沉淀用1ml 70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心10min，去上液11. 无水乙醇洗涤一次，12000rpm离心10min，去上液，倒置于吸水纸上，在超净工作台下吹干5min12. 重悬于50ul TE中，样品在-20