基因工程目的基因的分离PPT课件

1、.,1,第五章 基因工程 目的基因的分离,.,2,第一节 基因工程的工具酶,一、限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶（简称限制酶 restriction enzyme），是指在细胞内能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并在此位点对DNA分子进行切割的一种内切酶。,1952年，Luria和Human发现宿主控制性限制现象。 1、 限制修饰系统 包括限制酶和甲基化酶。1968年，Meselson和Yuan，Linn和Arber从E.coli菌株K和B中发现了型限制性核酸内切酶，接着，Smith和Wilcox于1970年分离纯化了第一个型限制性核酸内切酶。,.,3,宿主细胞对噬菌体感染的限制-修

2、饰作用,.,4,2、限制性核酸内切酶的类型,（2）型限制性核酸内切酶,型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。型酶需要Mg2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因子。切割方式也很奇特，它结合在识别位点，以滚环方式沿DNA转位，而后距其识别位点5侧数千个碱基处随机切割。,III型酶与型酶基本相似，但是III型酶具有特异性的切割位点，在识别点的3端2426bp处。,它的切点与识别位点是一致的。由于型酶的该特点，且反应中不需要ATP、S-腺苷甲硫氨酸作为辅因子，因而是基因工程中使用的主要工具酶。,（1）型和III型限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶分为3种类型：I型、II型和III型,

3、.,5,3、型限制性核酸内切酶的基本特点,（1）识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，其长度一般为48个核苷酸，且具有双重旋转对称的结构形式。,其中，大写字母代表核苷酸碱基，带撇的大写字母则代表互补的核苷酸碱基，N是代表任意一种核苷酸，垂直线代表对称轴。,（2）具有特定的酶切位点,A、粘性末端 a、5突出粘性末端如限制酶Pst-,它识别6核苷酸序列，产生4核苷酸5-粘性末端序列。 5 -CTCGAG- 3 5 -CTCGA- -G- 3 3 -GAGCTC- 5 3 -G- -AGCTC- 5,.,6,b、3突出粘末端,B、平端,如：从流感噬血菌（Haemophilus influenzae）分

4、离出来的一种限制酶，其识别序列和切割位点为： 5-AAGCTT- 3 -5-A- -AGCTT-3 3-TTCGAA- 5 -3-TTCGA- -A-5,例限制酶Hae III，它识别4核苷酸序列，切割点产生平口末端。 5 -CGCC- 3 5 -GG- -CC- 3 3 -CCGG- 5 3 -CC- -GG- 5,.,7,（3）类限制一修饰系统的甲基化酶,4. 限制性核酸内切酶的特异特点,维持维持性甲基化酶：指新合成的DNA链上的甲基化与模板DNA链上的甲基化位置相同。 构建性甲基化酶：该酶可在非甲基化的DNA链上新甲基化。,1（1）同裂酶 来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割位点和形

5、成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。 如：Hpa和Msp，它们的识别序列均为CCGG，切割位点均为CCGG。有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏感性不同。在不含有甲基时，Hpa和Msp均可对其切割，如果胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶，则Msp可以切割它，而Hpa就不能切割此序列。,.,8,（2）同尾酶,来源不同，识别的核苷酸序列也不同，但切割后DNA分子产生的粘性末端却相同，这种酶称为同尾酶。,Sal 5 -GTCGAC- 3 5 -G- -TCGAG- 3 3 -CAGCTG- 5 3 -CAGCT -G- 5 和 Xho 5 -CTCGAG- 3 5 -C- -TCGAG- 3 3 -G

6、AGCTC- 5 3 -GAGCT -C- 5 两个粘性末端再连接后，产生 5 -GTCGAG- 3 3 -CAGCTC- 5 该DNA既不能为Sal也不能为Xho所识别。,.,9,5、限制性核酸内切酶的命名,6、限制性核酸内切酶识别序列的长度与识别位点的频率,（1）第一个字母是酶来源物种的属名的第一个字母，且大写；第二、三个字母是酶来源的种名的前两个字母，用小写。该3个字母是酶的名称； （2）若有特殊的菌株，在3个字母后加菌株号，用变种或品系的第一个字母，且大写； （3）如果一种特殊寄主菌株分离出几个不同的限制修饰体系，按照发现和分离的顺序用罗马数字、III表示。 如从大肠杆菌（Escher

7、ichia coli）R株分离的第一种限制酶称为EcoRI,在DNA 中，若A、T、G、C四种核苷酸以相同频率出现，那么，一段DNA中，某一内切酶识别的位点，即核苷酸随机结合的位点的数量为1/4n (n为识别序列的长度)。,.,10,二、DNA连接酶,三、DNA聚合酶,能够催化DNA中相邻的3-羟基和5-磷酸基末端之间形成3，5-磷酸二酯键，,1、T4DNA连接酶 可连接带匹配粘末端的DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。,2、大肠杆菌DNA连接酶,是基因工程中常用的一种酶，此酶在全酶时（分子量109000D）主要有3种酶活性：，,1、大肠杆菌DNA聚合酶I,只能连接带匹配粘末端的D

8、NA分子,.,11,AATTC G,G CTTAA,AATTC G,G CTTAA,5,5,5,5,(1) (2),AATTC G,G CTTAA,AATTC G,G CTTAA,5,5,5,5,(a)分子间连接,(b)分子内连接,(1) (2),AT,G,C,T,A,TA,G,C,T,A,T4连接酶,T4连接酶,.,12,1、 53聚合酶活性：,2、53外切酶活性,GATAGCC AGCTATCGG,TCGATAGCC AGCTATCGG,E.coli DNApolI,Mg 2+,+ pC，pT,3、35外切酶活性,TCGATAGCC AGCTAT,E.coli DNApolI,Mg 2+,

9、TCGATA AGCTAT,+ pC，pG，pC,5,5,.,13,2、Klenow片段,DNA聚合酶还可被枯草杆菌蛋白酶水解为2个片段，其中的大片段（Klenow片段，分子量76000D）具有53聚合酶活性和35外切酶活性,四、逆转录酶,1、 53DNA聚合酶活性,2、RNA酶H的活性， 即53和35外切核糖核酸酶活性 ，但无35脱氧核糖核酸酶活性，即无校对功能。,.,14,五、末端脱氧核苷酸转移酶,六、T4噬菌体多核苷酸激酶,简称末端转移酶，它是从小牛胸腺中分离得到。该酶能将脱氧核苷酸逐个地加到DNA分子的3-羟基上，不需要模板。4种dNTPs中的任意一种都能作为它的前体物。,当反应混合物

10、中只有一种dNTP时，就可以形成仅由一种核苷酸组成的尾巴，我们特称这种尾巴为同聚物尾。,该酶可催化ATP的磷酸转移到DNA或RNA5-OH末端。,在杂交探针制备中，可用来标记DNA片段的5端；,基因的化学合成中，使寡核苷酸片段5磷酸化；,DNA测序中，测序引物5磷酸标记。,用途：,.,15,七、碱性磷酸酶,八、S1核酸酶,细菌碱性磷酸酶,小牛肠碱性磷酸酶,作用：可去除DNA或RNA5末端的磷酸 。,S1核酸酶主要功能是催化RNA和单链DNA分子降解为5单核苷酸，同时也能作用于双链DNA分子的单链区，并从此切断DNA分子。,dNMPs，drNMPs,Zn 2+,pH4.5,Zn 2+,pH4.5

11、,.,16,九、Bal31核酸酶,1、核酸内切酶活性（同S1核酸酶）,2、双链特异性外切酶活性,用途：,（1）诱发DNA发生缺失突变 （2）定位测定DNA片段中限制位点分布 （3）研究超盘旋DNA分子的二极结构,十、核酶,核酶不是蛋白质，而是具有酶活性的RNA片段 。,Ca 2+,.,17,第二节 目的基因的分离,一、化学合成法,1、基因片段的全化学合成,2、基因片段的化学-酶促合成,二、基因的酶促合成（逆转录法）,mRNA,cDNA,逆转录酶,.,18,图1 基因的化学合成及克隆,.,19,图2 基因的化学-酶促合成,.,20,三、基因文库分离目的基因,（一）基因组文库的建立,基因文库：指某

12、一生物的全部基因的集合。,基因组文库：指用全基因组DNA，通过几种限制性内切酶切割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克隆，由此产生的克隆群体包含了基因组DNA的所有序列，称基因组文库。,基因组文库的大小的估算：,N=ln（1P）/ln（1 f）,N：为基因组文库必需的克隆数目。 P：为文库中含目的基因DNA片段的出现概率。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。,.,21,基因组文库应具有的克隆子数,.,22,（二）、cDNA文库的建立,总RNA,mRNA tRNA rRNA,cDNA文库：指用一种生物的mRNA经逆转录合成的互补DNA所建立的文库。,2、合成cDNA第一条链,（1）随

13、机引物引导法,（2）oligo（dT）引导法,1、mRNA分离,.,23,（1）随机引物引导法,（2）oligo（dT）引导法,dNTP,.,24,3、第二条链的合成,（1）自身引导法,.,25,（2）双链cDNA的置换合成,.,26,（3）引物-衔接头法双链DNA的合成,.,27,（三）在cDNA文库中分离基因,1、探针的设计,根据DNAmRNA蛋白质的“中心法则”,2、切口平移技术制备DNA探针,氨基端MetProGluGly羧基端。其中Met只有AUG一个密码子，Pro有4 个可能的密码子，Glu也有4 个可能的密码子，Gly有2个可能的密码子。这些密码子经随机排列，可能出现144232

14、种可能的组合。,.,28,5,5,3,3, EcoR,5,5,3,3,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,图 DNA聚合酶的切口平移,.,29,四、mRNA差别显示分离目的基因,五、利用转座子分离目的基因,mRNA差别显示技术也叫DDRT-PCR（differential display RT-PCR），即差异显示RT-PCR。,转座子（transponson）是一类带有完整复制系统和转位技能的大片段DNA分子，它可以出入染色体，在整合到染色体上时，可影响到它两端基因的活性和表达，在从染色体上解离下来时，可带走部分DNA片段或一个完整基因，因此转座子又叫跳跃基因 。,.,30,1948年美国女遗传学家McClintock 在玉米中首先发现的，叫Ac/Ds系统。,.,31,转座子目前作为一种重要的标签（tag）在基因组图谱中有重要位置 。,.,32,六、基因芯片技术分离目的基因,基因芯片：是指将许多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段（包括cDNA）固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样品标记后同芯片进行杂交，通过杂交信息的分析来检测基因的功能和基因组研究的分析系统。,1、制作方法,点接触法,喷墨法,光刻合成法,2、