第十四章 高效液相色谱法.ppt

1、2020/12/4,第十四章 高效液相色谱法,14-1 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法又称高压液相色谱法。它是在经典色谱和气相色谱法的基础上发展起来的，在色谱理论方面没有本质的差别。但由于采用了高效固定相、高压输液泵、高灵敏度检测器等新技术，因而有了更高的效率并实现了自动化。,2020/12/4,2020/12/4,与经典色谱的比较,与气相色谱比较 以溶剂作流动相，流动相参与分离作用，分离能力强；适用范围广，气相色谱分离分析的化合物只占化合物的30，而高效色谱对高沸点、热不稳定、大分子量、离子型化合物等都有效，适合于生命物质的分析；分析过程中一般不破坏物质，因而可以方便地制备色谱纯物质。

2、,2020/12/4,14-2 高压液相色谱仪 高压液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统五大部分组成。,2020/12/4,1高压输入系统：贮液槽、高压泵 高压泵提供输出压力为150500kg/cm2，流速为0.1-10mL/min 连续可调、流量恒定、无脉动的流动相压力和流速。 高压泵按性质分成恒流泵（往复式柱塞泵、注射式螺旋泵）和恒压泵（气动泵）。 梯度洗脱装置：外梯度装置（常压梯度）和内梯度装置（高压梯度）。 2进样系统：进样口、注射器和进样阀隔膜进样和六通阀进样,2020/12/4,3分离系统：色谱柱和恒温室 4检测器：检测器分为溶质性检测器（只对流动相中的

3、被分离分析组分的物理或物理化学性质有响应）和总体型检测器（对流动相的总的物理或物理化学性质有响应）。 （1）溶质性检测器：紫外（UVD）、荧光（FLD）、电化学（ECD）检测器等。 紫外检测器基于被测组分对特定波长的紫外光的选择性吸收，且吸收符合光吸收定律。因此可以进行定性定量分析。可测10-9g/mL的物质。,2020/12/4,a固定波长型检测器是一种光源波长固定的紫外光度计，一般由低压汞灯作光源，发射波长为254nm波长的光。对在254nm波长附近有吸收的物质有响应。 b可变波长型检测器是一台紫外可见分光光度计，波长任意可调。 c光电二极管阵列型是一种新型记录方式的紫外检测器。它由光源、

4、光栅、二极管阵列和计算机组成。光源发射的光被组分选择性吸收，经光栅分光后照射到二极管阵列上，使每纳米光波的光强变成相应的电信号，经累积和计算机处理后得到试样或每个组分的吸收光谱。可以获得t、A、的三维图光谱和色谱图的加合图。,2020/12/4,荧光检测器是一台荧光光度计，其选择性和灵敏度优于紫外检测器，但应用范围窄。可测10-12g/mL的物质。 电化学检测器是一种选择性检测器，利用组分在氧化还原反应过程中产生的电流或电压变化来对组分进行检测。可测10-9g/mL的物质。 （2）总体型检测器：示差折光检测器（RID），是一种通用型检测器，利用样品池和参比池之间折光指数的差别来对组分进行检测。

5、折光指数的差别与组分的浓度成正比。,2020/12/4,14-3 基本理论 高效液色谱法的分离原理与经典色谱法一致（吸附、分配、交换、排阻）；其基本理论及色谱流程与气相色谱法相似；如塔板理论、速率理论、保留值、分离度等都可用于高效液相色谱法。两者不同的是流动相，因而在基本理论方面需要考虑这些特点。其影响最大的是速率理论。 描述其板高与影响因素关系的范氏方程如下：,涡流 纵向 流动相传阻 滞留流动相传阻 固定相传阻,HAB/uCu,2020/12/4,上式中,各符号的意义与气相色谱的范氏方程相似。 但在液相色谱中B/u很小，可以忽略，则： HACu 因此： 减小固定相的颗粒直径，可以提高柱效；

6、降低流动相的粘度或提高柱温，可以增大D，有利于提高柱效； 在一定范围内减小流动相线速，有利于提高柱效； 提高装柱技术，可减小涡流扩散，提高柱效。,2020/12/4,14-4 液-固色谱法 液固色谱法的固定相是固体吸附剂，其分离机理与经典色谱法相同，是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。 1吸附作用 吸附平衡 Xm+nYs=Xs+nYm,式中：m表示流动相、s表示固定相、X表示溶质、Y表示固定相活性基团或流动相分子。Ymn/Ysn可视为常数，因为Y是大量的；故吸附系数与分配系数的表示形式一致。吸附系数越大，越容易被吸附，在柱内的保留时间越长；反之则反。,2020/12/4,2固定相

7、（1）液固色谱固定相可分为极性和非极性两大类： 极性： 硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、 聚酰胺及分子筛 非极性：活性炭 极性固定相又分为酸性和碱性： 酸性：硅胶、硅酸镁等按组分的碱性进行分离； 碱性：氧化铝、氧化镁等按组分的酸性进行分离。 （2）液固色谱固定相按结构和状态分为：薄壳型、全多孔微粒型（见表）。它们都必须符合：强度大、颗粒小、表面积大、孔径均匀等的要求。,2020/12/4,3流动相 高效液相色谱法对流动相的要求：不与固定相发生不可逆化学变化；溶解样品；与检测器相配；粘度小，有利于获得高柱效；廉价、毒性小、易于纯化等。 其选择原则：极性大的试样，选用极性较强的溶剂；极性小的则用低极

8、性的溶剂。试样极性、固定相极性及流动相极性之间的配合与经典色谱法相似。,2020/12/4,14-5 液-液色谱法 1液-液色谱法 又称液-液分配色谱法，是马丁及辛格于1941年创立的；分离决定于分配系数。但在高效液相色谱法中，使用的固定相是经特殊处理得到的。用涂渍法得到的固定相，由于使用溶剂流动相，故固定液容易流失。为了解决这一矛盾，或采用化学键合固定相，或采用正相、反相色谱法。 正相色谱法使用极性固定相、非极性溶剂作流动相的液液分配色谱法；即流动相的极性低于固定相的极性的液-液分配色谱法。 反相色谱法使用非极性固定相、极性溶剂作流动相的液液分配色谱法；即流动相的极性高于固定相的极性的液-液

9、分配色谱法。,2020/12/4,2化学键合相色谱法 （1）定义：化学键合相色谱法实质上是利用化学键合固定相进行分离的分配色谱法。但在分离机制和固定相特点方面有差别，故单独讲解。 根据键合和流动相间的相对极性强弱，键合色谱法又分为极性键合相色谱法和非极性键合相色谱法。极性键合相色谱法由于流动相的极性小于固定相极性，所以为正相色谱法；弱极性键合相可作为正相也可作为反相色谱法；非极性键合相色谱法一般为反相色谱法。,2020/12/4,（2）化学键合固定相 目前化学键合固定相一般以硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体，经酸、碱洗、中和、干燥和活化等处理后，再利用表面上的硅羟基与某种有机物或有机硅化合物

10、反应，制备成化学键合固定相。 键合上去的有机基团主要有三大类： 疏水基团不同链长的烷基和苯基等； 极性基团氨基、氰基、醚基和醇基等； 离子交换基团阴离子交换基团胺基、季铵基、阳离子交换基团磺酸基。,2020/12/4,键合键型有四类： 硅酸酯型（Si-O-C）键合相醇与硅羟基进行酯化反应得到；以弱极性溶剂洗脱，分离极性化合物。,硅氮型（Si-N=）键合相先用酰氯将硅羟基氯化，再与氨基化合物反应得到； 可用非极性和强极性的溶剂作流动相。,2020/12/4,硅碳型（Si-C）型键合相先用酰氯将硅羟基氯化，再与格氏试剂反应，引进有机基团得到：,硅氧烷型（Si-O-Si-C）键合相硅羟基与有机氯硅烷

11、或烷氧基硅烷反应得到：,是目前广泛应用的键合相，可在pH29的条件下工作。,2020/12/4,（3）反相键合相色谱法 以硅烷基或硅苯基非极性键合相作固定相，以强极性溶剂为流动相(甲醇水、乙醇水、水、缓冲溶液等)的色谱法。 目前人们对反键合相色谱法的分离机理（保留机制）有不同的看法：或认为是分配色谱，或认为是吸附色谱。吸附色谱的作用机制可以用疏溶剂理论来解释。即组分分子的非极性部分与固定相的作用力强，与溶剂的作用力小；组分分子的极性部分与固定相的作用力弱，与溶剂的作用力强；因此不同极性的组分被分离。,2020/12/4,（4）正相键合相色谱法 以含有极性基团（氰基、氨基、二醇基等）的极性键合相

12、作固定相，以非极性或弱极性溶剂作流动相的色谱法。主要用于分离异构体和极性不同的化合物。 （5）离子键合相色谱法 以含有离子交换基团（磺基、氨基、羧基等）的键合相为固定相，以络合剂或缓冲剂为流动相的色谱法。,2020/12/4,14-6 离子交换色谱法 1离子交换色谱法：以离子交换树脂为固定相。 （1）原理交换平衡 阳离子交换 RSH+M=RS M+H 阴离子交换 RNCl +X =RNX +Cl ,KMH和KXCl是交换平衡常数。离子交换树脂上与基质所带电荷相反的离子，称为反离子（如，H+ 和Cl-离子）。当考虑被分析离子和反离子的分配时，其分配系数分别为：,2020/12/4,被分析离子的分

13、配系数越大，则在柱中的保留时间越长。由上述分配系数的定义不难看出，在离子色谱中，可以通过控制流动相中的反离子浓度、离子强度和离子类型控制交换平衡，从而控制被分离组分的容量因子k，从而获得好的分离选择性和柱效。 （2）固定相离子交换树脂 按交换基团的不同，离子交换树脂分为阳离子和阴离子交换树脂。,2020/12/4,（3）流动相水溶液、有机溶剂及其混合物。 在离子色谱中，可以通过控制流动相中的反离子浓度、离子强度和离子类型及pH值控制交换平衡，从而控制被分离组分的容量因子k，从而获得好的分离选择性和柱效。一般说来，增加反离子的浓度，可降低被分离离子竞争吸附的能力，从而降低其在固定相上的保留值；改

14、变反离子的类型，有时能显著地改变被分离离子的保留值。 离子交换色谱法主要用于分离离子或可离解化合物，不仅应用于无机离子也用于有机及生物物质的分离。,2020/12/4,2离子对色谱法 （1）离子对色谱法 离子对色谱法将一种或多种与被分离组分电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加入流动或固定相中，它们与被分离组分形成离子对，从而控制被分离组分的保留值的色谱法。例如， Baq+ + Paq- = (B+P-)org 可见离子对的体积较大，又无净电荷，所以有显著的疏水性；离子有亲水性，离子对有疏水性（亲油性）；故可将萃取原理用来讨论离子对色谱的分离问题。选择合适的反离子和浓度，就能有效地将被分离组分

15、萃取进有机相。如以水作为固定相，有机溶剂为流动相（正相离子对色谱），离子对容易流出色谱柱；相反（反离子对色谱），则离子对被保留。,2020/12/4,（2）键合相反离子对色谱法 用非极性烷基键合相为固定相，以低浓度反离子的水溶性缓冲溶液为流动相的色谱法。与键合相反相色谱法一样。常用的流动相是水甲醇或水乙腈混合溶剂。当分离碱时，可将辛基磺酸盐等有机盐加入流动相作为反离子；当分离酸时，则用磷酸四丁铵加入流动相作为反离子。这类色谱法近年来得到广泛的应用。,2020/12/4,14-7 凝胶渗透色谱法 凝胶渗透色谱法又称空间排阻色谱法，它是基于被分离组分的分子大小和形状不同来实现分离的。 凝胶渗透色谱

16、的固定相是凝胶，是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔径或立体网状的物质。凝胶渗透色谱的流动相是仅作组分载体而不与组分或固定相发生作用的、可溶解试样的物质（如：四氢呋喃、十氢化萘、氯仿、二甲基甲酰胺等）。,2020/12/4,在分离过程中，试样中小分子量的分子（尺寸小），进入凝胶的孔穴内而保留，试样中的大分子，被排斥在凝胶的孔外而随流动相流出。所以大分子在柱内的停留时间短，小分子由于可以进入凝胶孔穴的深处，而保留时间长。故凝胶渗透色谱又称为反筛子。 由于一定凝胶的孔径大小一定，因此，一定凝胶对分子大小的排斥有一定的排斥极限即一定分子量大小的分子，因为分子尺寸一般随分子量的增大而增大。排斥极限定义为可进入一定凝胶孔穴分子的最小分子量。上图表明了，凝胶渗透色谱的分离原理，排斥极限为105，渗透极限为102 ,可分离的组分分子量落在渗透极限和排斥极限之间。,2020/12/4,2020/12/4,14-8 色谱分离方法的选择 考虑分离方法的选择