第二章微生物的纯培养和显微技术

1、第二章 微生物的纯培养和显微技术第一节 微生物的分离和纯培养一、 无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。（3）高温干热灭菌。2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。二、 用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 菌苔：当固体培养基表面众多菌落

2、连成一片时，便成为菌苔。2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。三、 用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。四、 单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混

3、杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。较大的微生物较容易，个体较小的较难。对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。五、 选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。六、 微生物的保藏技术1、传代培养保藏琼脂斜面、半固体琼脂柱、液体培养。选择合适的培养基，并在规定时间内移种。通过降低微生物的代谢水

4、平或防止培养基干燥，可延长保藏时间。（悬液保藏法）繁琐、容易污染，菌种自发突变导致菌种衰退。2、冷冻保藏体积大的比体积小的对低温更敏感，无细胞壁的对有细胞壁的更敏感。低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。速冻、快速升温。加入保护剂。（液氮冷藏-196、冰箱保藏）3、干燥保藏法（1）沙土管保存：适用于产孢子的微生物，培养后洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌沙土管中，减压干燥，直至水分抽干，封闭管口，置冰箱保存。（2）冷冻真空保藏：将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，在真空中通过冰的升华除去水分，在真空或惰性气体的密闭环境中低温保存。干燥、低温、缺氧。（目前最普遍最重要

5、）第二节、显微镜和显微技术一、 显微镜的种类和原理1、普通光学显微镜机械装置和光学系统。2、暗视野显微镜利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜。因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。主要用于观察生活细菌的运动性。3、相差显微镜细胞不同部位密度不同，折射率和厚度不同，直射光和衍射光的光程就会有差别。相差显微镜的环状光阑和相差板，将光的相位差转变为振幅差（明暗差），使得原来透明的物体表现出明暗差异。观察活细胞和某些细微结构。4、荧光显微镜原理：紫外线照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体。5、透射电子显微镜TEM电磁波代替可见

6、光，工作原理与光学显微镜十分相似。6、扫描电子显微镜SEM工作原理类似于电视或电传真照片。主要用于观察样品的表面结构，成像具有立体感。7、扫描隧道显微镜STM利用了量子力学的隧道反应。目前分辨率最高，可避免样品的变形。二、显微观察样品的制备1、光学显微镜的制样（1）活体观察采用压滴法、悬滴法、菌丝埋片法在明视野、暗视野、相差显微镜下观察。避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏，并可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性、生长过程中的形态变化。（2）染色观察固定样品：杀死细菌病使菌体粘附于玻片上；增加其对染料的亲和力。火焰加热和化学固定。染色：正染色（革兰氏染色）、负染色、活菌染色。

7、2、电子显微镜的制样样品在观察前必须进行固定和干燥，一般采用重金属盐染色或喷镀，提高反差。（1）透射电镜的样品制备1) 负染技术用电子密度高，本身不显示结构，与样品几乎不反应的物质来对样品染色。重金属盐不被样品吸附而是沉积到样品四周。2) 投影技术在真空蒸发设备中，将铂或铬等对电子散射能力较强的金属原子，由样品的斜上方进行喷镀，提高样品的反差。喷镀上的为暗区，没有喷镀上的为亮区，可了解样品的高度和立体形状。3) 超薄切片技术100nm一下的超薄切片，方能看清其内部的细微结构。取样、固定、脱水、浸透与包埋、切片、捞片、染色、观察（2）扫描电镜的样品制备利用电子束作光栅状扫描以取样品的形貌信息。要

8、求样品干燥，表面导电。所以需要去除水分，表面喷镀金属导电层。保持样品形状的关键是样品干燥。干燥方法有：自然干燥、真空干燥、冷冻干燥、临界点干燥。第三节 显微镜下的微生物一、细菌和古生菌1、细菌的形态和排列基本形态：球状、杆状、螺旋状放线菌菌丝：营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。孢子丝的形态特征是放线菌的重要鉴定指标。细菌形态明显受到环境条件的影响2、古生菌与细菌形态相似，多生活在条件恶劣的极端环境中，如高盐、高温、高酸3、原核生物的细胞大小显微镜测微尺、投影法制成照片，再按放大倍数测算。球菌大小以其直径表示，杆菌和螺旋菌以其长度和宽度表示。二、真菌霉菌、酵母菌、大型真菌都是真核微生物1、霉菌：丝状真菌的统称，霉菌菌体均由分支或不分支的菌丝构成。许多菌丝交织在一起，成为菌丝体。霉菌菌丝有两类：无隔膜菌丝，长管状单细胞，生长表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多以及细胞质的增加；有隔膜菌丝，多细胞。固体培养基上：营养菌丝，部分菌丝伸入培养基内吸收养料； 气生菌丝，向空中生长； 繁殖菌丝，气生菌丝发育到一定阶段分化而成。可