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文档简介
1、实验二十五 真核基因组DNA分离纯化 外周血白细胞提取DNA(NaI法),实验二十五 NaI法提取外周血白细胞 DNA 学时数:3 教学目的:掌握NaI法提取外周血白细胞DNA的原理和方法。 教学重点:实验原理与过程 教学难点:实验原理与方法 使用教具:多媒体 教学方法:互动式、讨论式教学法 讲授内容纲要、要求及时间分配 导入:(用一部著名电影导入正题,激发学生探索生命奥秘的兴趣) 12 min 交代正题: NaI法提取外周血白细胞DNA 1 min (一)实验目的(简明扼要) 1 min (二)实验原理(提出问题,学生阅读,在问题中理解实验原理) 1214 min (三)实验材料 3 min
2、 (四)实验步骤(思路清晰,结合原理讲解) 1516 min (五)注意事项 2 min (六)实验报告 1 min,引言:1min 美国好莱坞电影侏罗纪公园总票房超过3亿美元同时也创造了一种大胆的科学设想:一只蚊子吸取了恐龙的血液,蚊子恰巧又被琥珀完美保存至今日,科学家因此获取了恐龙的DNA,再现了恐龙时代。,真核基因组DNA的分离纯化,回忆理论知识 1.真核生物的核酸类型和分布 2.真核生物DNA的结构,核酸的分离纯化,(一)原则:保证核酸一级结构的完整;排除蛋白质、脂类、多糖等其他分子的污染;无其他核酸分子的污染。,(二)步骤:破碎细胞,去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,
3、去除其他不需要的核酸分子,沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质,最后得到纯化的核酸。,NaI法提取外周血白细胞DNA,实验目的:掌握NaI法提取外周血白细胞DNA的原理和方法。,用NaI法提取白细胞中的DNA可用于Southern杂交、PCR等。 例如做亲子鉴定可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。,1.NaI起什么作用? 2.如何将DNA从蛋白质中释放出来?,思考:,实验原理:从全血制备白细胞DNA,可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜,释放出血红蛋白及细胞核,使核酸处于易提取状态,加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离,用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全,DNA
4、存在于上层水相中,以异丙醇沉淀DNA,离心弃去异丙醇,并重复操作一次,即可获得白细胞DNA。,实验材料,1.器材 (1)高速冷冻离心机。 (2)自动移液器。 (3)枪头、1.5ml离心管(高压灭菌) 2.试剂 (1)6mol/LNaI (2)氯仿/异戊醇(24:1V/V) (3)纯异丙醇(AR) (4)37%异丙醇 (5)双蒸水(高压灭菌) (6)TE缓冲液(PH8.0)高压灭菌,1.取消毒EP管,做好标记,取外周抗凝血(全血)100ul于EP管中,以10000rpm离心1min 。 2.弃上清,加双蒸水200ul溶解,摇匀20s。(破红细胞、白细胞膜) 3.混匀后加6M NaI溶液200ul
5、,缓慢摇匀20s。(破核膜,使DNA从核蛋白中解离) 4.加入氯仿/异戊醇(241)400ul,边加边摇,摇匀20s,12000rpm离心12min。,实验步骤,(思考:每个步骤的作用?),7.弃37异丙醇,敞开EP管盖,倒扣在滤纸上将37异丙醇吸干,或放在超净台上吹干,加1xTE溶液30ul,溶解DNA12h以上,制成的DNA液以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20冰箱保存。,5.取上层液360ul,加入另一新EP管中,加0.6倍体积异丙醇,摇匀20s,室温放置15min,静置后的反应体系14000rpm离心12min,使沉淀紧贴EP管壁。 6.弃异丙醇,加37异丙醇1ml(不振动),以14000rpm离心12min。,2.混匀试剂、吸取上清等操作时避免动作剧烈。 3.弃异丙醇时动作应轻,切忌甩干,以免DNA丢失。 4.DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去,所以常规需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。,注意事项: 1.标本必须新鲜,提取前细胞应保持完整。所用EP管、吸嘴等器物及ddH2O、试剂等应高压灭菌,操作尽量在4以下进行。,实验题目 实验目的 实验原理 实验仪器 实验步骤 实验过程及实验数据记录 实验数据
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