生物技术综合实验课：实验八 重组DNA的转化

1、,实验八 重组DNA的转化,一.实验目的 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 学习和掌握质粒DNA的转化方法及操作步骤。,二. 原理 质粒必须通过转化，才能进入细菌内进行扩增。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。用CaCl2处理细菌可以提高细菌吸收周围环境中的DNA分子,这种状态的细菌被称为感受态细菌。 冰冷条件下，CaCl2能使细菌细胞膨胀，细胞壁通透性增强，转移到42下进行短暂热刺激，待转化的外源DNA便会被细胞所吸收。 决定细菌转化效率（频率）的因素有：DNA的浓度、纯度和构型；转化细胞的生长状态；在CaCl2处理和储藏之后的存活率以及转化的环境条件如：温度、pH值、离子浓

2、度等。,重组质粒的筛选（-互补法）： PUC质粒系列都带有一个大肠杆菌的短区段，其中含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息，该编码区中插入了一个多克隆位点，它不破坏读码框，但可以使少数几个氨基酸插入其N端，而不影响功能。这种载体使用于编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞（如DH5）。这样， lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种现象称为-互补。由-互补产生的Lac+细菌在生色底物X-gal存在下形成兰色菌落。外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，不可避免地导致产生无-互补能力的氨基片段

3、，因此带重组质粒的细菌形成白色菌落。,plasmid DNA,host DH5,Lac Z-N端,Lac Z-C端,-互补,-半乳糖苷酶基因,三. 试剂与器材 一试剂 1LB培养基: 在950ml水中加入: bacto-tryptone 10g bacto-yeast extract 5g NaCl 10g 用5 mol/LNaOH调pH至7.0 加水至1L,高压灭菌。,2. LB/Amp平板:在950ml水中加入: bacto-tryptone 10g bacto-yeast extract 5g NaCl 10g 用5 mol/L NaOH调pH至7.0 加15g琼脂，加水至1L,高压灭菌

4、，冷却至50,加氨苄青霉素至终浓度60g/ml。,IPTG储存液：200mg/ml的双蒸水溶液，用0.22m的一次性滤器过滤除菌，-20 保存。 X-gal储存液：20mg/ml的二甲基甲酰胺溶液，不必除菌，-20 保存。 0.1 mol/L CaCl2(过滤除菌) 甘油(灭菌),二器材 1. 37温箱、水浴锅、恒温振荡器 2. 高速冷冻离心机,四.操作步骤 1、DNA片段的连接,根据目的片段和载体大小，以等摩尔比（载体DNA：插入DNA片段=1:2 1:3）计算各自DNA加样量,连接体系：,台式离心机离心10秒以混合均匀，16连接4小时至过夜，连接产物存放于4或直接转化细菌。,四.操作步骤-

5、续 2. 感受态细胞的制备: 挑单个菌落接种到20 ml LB培养基中，37剧烈振荡过夜。 取1ml过夜培养物, 接种到25ml LB培养基中, 37振荡培养1-2小时，直至培养夜中细菌浓度达到A600为0.2-0.4(细菌对数期生长)。或取1ml甘油菌，接种到100ml LB培养基中， 37振荡培养1-2小时。(共接两瓶) 培养物冰上放置10min ，4000rpm, 4离心10分钟，收集菌体。,将菌体悬浮于5 ml预冷的CaCl2 中, 冰上放置20分钟。 4000rpm, 4,离心10分钟，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在2 ml CaCl2 中，0-4 保存24至48小时。 或缓慢滴入甘油

6、(灭菌)至浓度为15,轻柔混匀，将细菌分装成0.2ml/每管，干冰上放置1小时，转入-80冰箱储存。,3. 感受态细胞的转化 在10 l连接反应物中取2-4 l （50ng）加于200 l 感受态细菌，冰浴中放置30分钟，同时设对照：a:标准质粒DNA；b:不加DNA的感受态细胞；c:载体自连对照；。 42热激90秒后，立即放回冰浴中。3-5分钟后补加LB液体（不加抗生素）800 l，于37 振摇45-60分钟。 事先将40 l X-gal和4 l IPTG均匀涂布于一个LB(Amp+)平板上，37 培养至整个溶液消失（约3-4小时）。,取100l或200l细菌培养液，直接涂布于此含60g/ml氨苄青霉素的平板上，于37 培养14-16小时，观察平板上的细菌密度并通过显色反应（白色菌落），初步确定含有重组质粒的阳性菌落。一般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌比无活性酶的细菌生长慢，故过夜培养后可见到毫米大小的阳性白色菌落而阴性的兰色菌落只有针尖大小。于4 将平板放置数小时使兰色充分显现。 通过质粒DNA提取鉴定重组子。,五、注意事项 -80冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定感受态细胞的转化