毕赤酵母的基因表达及其初步纯化 课件

1、4A,15,基因在毕赤氏酵母中的分泌表达,及,初步纯化,Alade,毕赤氏酵母作为表达载体的优点,1,表达效率高，遗传稳定性好,2,结构简单，表达调控机理比较清楚,3,有,Pr,加工系统,4,培养简单，成本低廉,5,表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的,分泌却很少，利于下游的纯化,毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达,系统。,一、实验材料,DH5,pPICZ,A,GS115,TOP10,pQE4A,15,pMD18T,载体,Pfu,高保真酶,T4DNA,连接,酶、限制性内切酶,PCR,产物纯化试剂盒,质粒提取试剂盒、羊抗鼠,IgG -HRP,增强,型,HRP-DAB,底物显色试剂盒,基因在毕赤

2、氏酵母中表达的简单过程,4A,15,基因的获取,PCR,目的基因的修饰与克隆,表达载体的构建,毕赤氏酵母的线性化、电转化与鉴定,目的基因在毕赤酵母,GS115,中的表达,重组蛋白的鉴定与分析,重组,4A 15,的初步纯化,1,目的基因,4A,15,获取,PCR,在设计,N,端引物时引入,Xho,酶切位点及,Kex2,信号肽水解位点，并删除,Kex2,后面,的,Ste3,位点,Glu-Ala-Glu-Ala,在下游引物,5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC ATA,3,引入终止密码子和,Xba,酶切位点,目的基因,4A,15,获取,PCR,以,pQE4A,15,为模板，

3、进行,PCR,扩增,扩增条件为,94,3 min,94,30 s,57,30 s,72,50 s,35,个循环,72,延伸,10 min,4,保存,1.5,琼脂糖分析,PCR,产物,2,目的基因的修饰与克隆,PCR,扩增产物回收后,克隆载体,pMD18T,以,1,3,V,的比例通过,T4,连接酶接,连接产物转入,大肠杆菌,DH5,菌落,PCR,分析阳性菌落：挑取,4,个阳性菌落,进行序,列分析,序列正确的命名为,p4A,15,3,表达载体的构建,双酶切基因片段,p4A,15,用试剂盒回收,双酶切质质粒,pPICZaA,回收大片段,定向连接，连接产物在低盐的,LB,平板上培,养,挑取抗性菌落提取

4、质粒，进行双酶切鉴定,5,毕赤氏酵母,GS115,的电转化与鉴定,5.1,电转化,1,线性化,限制性内切酶,B,st,XI,单酶切,表达载体和重组质粒,2,电转化,电激转化毕赤酵母,GSll5,感,受态细胞（转化条件：电压,1 500 V,4 ms,电转化完成后培养,转化物涂布于,Zeocin 100 mg /L,的,YPD,平,板上,28,恒温培养,36 h,左右，抗性平板,上生长的菌落相应的命名,GS115/pPICZaA,和,GS115/pPICZa4A,15,5,毕赤氏酵母,GS115,的电转化与鉴定,5.2,转化子的鉴定,提取抗性菌落的基因组,DNA,方法参见,Invitrogen,

5、酵母手册,以此基因组,DNA,为,模板,pPICZaA 5 Aox1 primer,和,3 Aox1,primer,为引物进行,PCR,1.5,的琼脂糖凝胶电泳分析,6,目的基因在毕赤酵母,GS115,中表达,挑阳性克隆单菌落接种于,BMGY,含酵母粉,甘油、生物素,的培养基上摇床培养,28,250 r /min,培养至,OD,600,为,26,离心收集菌体，用,BMMY,重悬，至,OD,600,1,继续摇床,每,24 h,向培养基中添加,无水甲,醇（诱导表,达产物分泌到培养基中,至终浓度为,1,每,24 h,取样，离心收集上清液，上清液用,丙酮沉淀后进行,12%SDS-PAGE,分析,对,G

6、S115,和,GS115 /pPICZaA,作同样的处理,以便于下游,SDS PAGE,的分析,6,重组蛋白的鉴定与分析,6.1 Western blotting,将丙酮沉淀后上清,12,聚丙烯酰凝胶电泳,转移至硝酸纤维膜,1% BSA,封闭硝酸,纤维膜,依次加入一抗,A,42,抗体）和二,抗（羊抗小鼠,HRP,标记,IgG,TBST,洗涤,5,次,HRP-DAB,底物显色试剂,盒显色,Western Blot,原理,a,Western Blot,与,Southern,印迹杂交,或,N,orthern,印迹杂交,方法类似，但,Western,Blot,采用的是,聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测,物是

7、蛋白质，,探针,是,抗体,显色,用标记的,二抗,Western Blot,原理,b,经过,PAGE,分离,的蛋白质样品，转移到固相,载体（例如,硝酸纤维素膜,NC,膜,上，固相,载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保,持电泳分离的,多肽类,型及其生物学活性不,变,Western Blot,原理,c,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应，再与,酶,或,同位,素,标记的第二抗体起反应，经过底物显色,或放射自显影以检测电泳分离的特异性目,的基因表达的蛋白成分,该技术也广泛应,用于检测蛋白水平的表达,Western Blot,操作步骤,1,蛋白样品制备,2,蛋白含量的测定,3,SD

8、S,PAGE,电泳,4,转膜,5,免疫反应,6,化学发光，显影，定影,7,凝胶图象分析,6,重组蛋白的鉴定与分析,6.2,质谱分析,从考染（考马斯亮蓝,R,250,CBR-250,用于检,测,Pr,的氨基和羧基）凝胶上切下重组蛋白,带,进行基质辅助激光解吸附电离飞行时,间质谱分析,7,重组,4A,15,的初步纯化,挑取阳性克隆单菌落接种于,BMGY,培养基中,28,250 r /min,培养至,OD,600,为,26,离心收集菌体，用,BMMY,重悬，至,OD,600,1,继续摇床,每,24 h,向培养基中添加无水甲醇至终浓度为,1,培养,48 h,离心收集上清液，分别加入固体硫酸铵至,其饱和

9、度,30% 40% 50% 60% 70,离心收集沉淀，取适量沉淀进行,12% SDS,PAGE,分析,并用,Band Scan,软件进行蛋白质纯度分析,蛋白质的分离纯化方法,Alade,四种分离纯化方法,1,根据,分子大小不同,进行分离纯化,2,根据,溶解度不同,进行分离纯化,3,根据,电荷不同,进行分离纯化,4,利用,对配体的特异亲和力,进行分离纯化,1,根据,分子大小不同,进行分离纯化,主要有,透析、超滤、离心和凝胶过滤,等,透析,和,超滤,是分离蛋白质时常用的方法,它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，除,去无机盐,2,根据,溶解度不同,进行分离纯化,影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如

10、,溶液的,pH,值、离子强度、介电常数和温度,等,常用的方法有,等电点沉淀,和,pH,值调节、蛋,白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相,萃取法、反胶团萃取法,等,3,根据,电荷不同,进行分离纯化,根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的,方法有,电泳,和,离子交换层析,两类,离子交换层析,IEC,是以离子交换剂为固定相,依据,流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行,可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种,层析方法,阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高,洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较,弱的蛋白质首先被洗脱下来,另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取,4,利用,对配体的特异亲和力,进行分,离纯化,亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子,特有的识别能力