生物大分子药物分析选论-考点药大的

1、1.质谱仪组成进样系统按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位；离子源用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束；质量分析器利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离；检测器用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。2.生物质谱的应用分子量的测定、蛋白质、多肽纯度的鉴定、肽质量指纹谱、肽序列测定技术 、蛋白质的翻译后修饰鉴定3.生物大分子色谱填料的特点孔径问题：普通介质的孔径610纳米：蛋白质、酶和核酸的分子量在1100万之间，粒径（溶质）

2、和孔径之比大于0.2时，溶质分子的扩散就受限制，不能完全接近固定相内表面。用于生物大分子分离的介质孔径大多为30纳米,1-3微米的无孔填料介质的亲水性：介质表面过多的疏水基团和电荷密度（如硅胶基质残余硅醇基）会引起蛋白质不可逆吸附，甚至变性。4. 生物素-酶标亲和素系统（BAS-ELISA）概念：生物素（biotin，B）：又称辅酶R或维生素H，是在动植物中广泛分布的一种生长因子，以辅酶形式参与各种羧化酶反应；亲和素（avidin，A）：又抗生物素蛋白、卵白素或亲和素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白；酶联免疫吸附试验（ ELISA ）：结合在固相载体上的抗原（抗体）与待检抗体（抗原）酶偶联

3、物（标记物）反应后，催化水解或氧化还原酶的相应底物呈色，其颜色深浅与待测抗原（抗体）含量成正比；BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。原理：利用结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。应用实例：人血清整分子胰岛素放大ELISA优越性：灵敏度高、特异性强、稳定性好，适用性广、快速、消耗少、实验成本低。5. 抗原-抗体抗原抗体反应：指抗原与相应杭体之间所发生的特异性结合反应。抗原抗体反应的特点：特异

4、性、可逆性、比例性。6. 生物大分子药物特点生物大分子(biomacromolecule) 是由低相对分子量的有机化合物经过聚合而成的多分子体系。生物体内这些分子或人工设计并制备的这类分子被用来治疗预防或诊断疾病则成为药物(顾名思义叫生物大分子药物)其分子量较大,结构也比较复杂。蛋白质的分子量在一万至数万左右，核酸的分子量有的竟达上百万,多糖的分子量从几万到上百万。且具有多级结构(一,二,三,四)。他们是有生命的分子,一旦高级结构变化,生命也将结束。制备工艺复杂，生物活性强，其它: 剂型, 给药途径, 储存.7.2014年生物新药举例：2个以上1. 关于多肽的化学合成目前主要是哪两种方法？简述

5、两种方法的优缺点。答：液相合成和固相合成；液相合成的优点是每步中间产物都可以纯化、可以获得中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失，缺点是较为费时、费力等；固相合成优点是简化了每步反应的后处理操作，避免因手工操作和物料转移而产生的损失，产率较高且能够实现自动化等，而其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须采用较大的氨基酸过量投料，粗品纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段进行纯化等。2. 合成多肽药物药学研究的主要内容包括哪几个方面？答：主要包括原料药的制备工艺研究和结构确证研究、制剂的处方工艺研究、质量研究和质量标准的制订、稳定性研究等。这些研究内容的一般性的技术要求

6、是和一般化学药物基本一致。3. 简述多肽结构研究的主要目的、方法。答：目的：是要说明其氨基酸组成和序列是否正确。多肽分子中如有半胱氨酸，应明确其状态（氧化态或还原态），对含有多个半胱氨酸的多肽，应明确二硫键的正确连接位点。对于某些长肽，可能还需要采用核磁共振、园二色谱等方法对其空间结构（例如二级、三级结构）进行研究。 方法：对于短肽，采用元素分析、红外光谱、核磁共振谱、氨基酸组成分析、质谱等常见方法；对于中、长肽应进行氨基酸组成和氨基酸序列分析。4. 中国药典收载了哪几种蛋白质含量测定方法？请分别简述其测定原理。答：见下表方法原理凯氏定氮法本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、

7、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量算出含氮量，再将含氮量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。福林酚法（Lowry法）本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸述原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。双缩脲法本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络

8、合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。2,2-联喹啉-4,4-二羧酸法（B C A法）本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu +，2，2联喹啉-4，4-二羧酸（BCA ) 与Cu+结合形成紫色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。考马斯亮蓝法（Bradford法）本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶

9、液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。紫外-可见分光光度法本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，其在2 8 0 n m波长处具最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。5.请简述你对蛋白质药物纯度测定的认识，并阐明纯度测定的常用方法。答：认识言之有理即可；方法：HPLC法和非还原SDS-PAGE法（检查的纯度都应达到95%以上，部分重组的药物要求达到99%以上）6.以尼妥珠单抗为例说明单抗药物的原液检定中包括哪些指标？为何要测定蛋白质A残留量，测定原理是什么？答：包括的指标有：鉴别试验（等电点、肽图、N-端氨基酸序列（至少每年测定1次）、p H 值、纯度和杂质、相对结合活性、蛋白质含量、细菌内毒素检查。 测定蛋白质A残留量的原因：因为其能与免疫球蛋白的Fc重链区结合并相互作用，这种类型的相互作用的结果是在血清中，细菌会在错误的方向（相对于正常抗体功能）结合在IgG分子表面，从而扰乱调理和吞噬作用。 原理：酶联免疫法，使抗原或抗体结合到某种固相载体