现代生物技术理论与实验：基因工程技术与应用

1、基因工程技术与应用,一、了解基因工程的诞生基础？,二、基因工程研究包括哪些技术？,三、基因工程等技术在药物研究的作用?,基因工程,一、概述,疫苗、多肽、 DNA等,转基因细胞 转基因动物,gene engineering,基因工程药物研究的意义,1. 许多疾病与单项或多项基因突变有关,2. 合成药和中药毒性大限制药物的使用,肿瘤、心血管、神经精神疾病、糖尿病,肾毒性、肝毒性、抑制骨髓等,有何意义呢？,生命科学,基因工程诞生发展过程,DNA结构和复制,限制性内切酶发现,操纵子学说,常用限制性内切酶,限制性内切酶,识别序列,AlvI AvaI BamHI Bgl II EcoR I Hind II

2、I Kpn I Pst I Pvu II Sau3A Sma I Xba I Xho I,AG CT C PyCGPuG G GATCC A GATCT G AATTC A AGCTT GGYAC C CTGCA G CAG GTG GATC CCC GGG T CTAGA C TCGAG,DNA连接酶的发现,1967年,发现 DNA连接酶,发现 T4-DNA连接酶,1970年,1972年,发现几种连接双链DNA的方法,EColi系统中DNA转移的实现,1970年发现 CaCl2处理细胞后进行转化,二、基因工程的定义,遗传信息,载体,重组,重组DNA分子,构成,细胞中表达,转染,DNA重组技术

3、的基本过程,（二）制备目的基因的DNA片段,（三）载体,（四）目的基因的 DNA片段与载体连接,（五）将重组分子转入受体细胞，并在其中复制、扩增,（六）筛选出带有重组DNA分子的转化细胞,（七）鉴定外源基因的表达产物,（一） 纯化 DNA,（一） 纯化 DNA,培养细胞和组织细胞,消化液（SDS、蛋白酶K),抽提（酚：氯仿：异戊醇),纯化（乙醇沉淀或透析）,定量（260/2801.7）,（二）制备目的基因的DNA片段,1. 鸟枪法,I 类：EcoR ATP, Mg2+, S-腺苷蛋氨酸,5- G A A T T C - G A A T T C -3,3- C T T A A G - C T T

4、 A A G -5,5- G A A T T C - G A A T T C -3,3- C T T A A G - C T T A A G -5,5- G A A T T C - G A A T T C -3,3- C T T A A G - C T T A A G -5,I I类： Mg2+,III 类： ATP, Mg2+, S-腺苷蛋氨酸,24-26 个,24-26 个,制备目的基因的DNA片段,2. cDNA法,mRNA,Poly A,Olig dT,Olig dT,反转录酶 + dNTP + 寡聚dT引物,S1核酸酶,DNA聚合酶 + dNTPs,cDNA,Ds-cDNA,3. 人

5、工合成法,载体的要求：,（三）载体,1. 在宿主细胞中能自主复制，分子量较小。,2. 有明显而方便的筛选标记。,对某些限制性内切酶只有一个切口，并在酶作用后不影响其 自主繁殖能力,4. 在宿主中能以多拷贝形式存在。,5. 有利于被插入的外源基因表达。,6. 能在宿主中稳定地遗传。,质粒的研究,（四）基因与载体的连接,1. 粘端的连接,图. 用一种内切酶切开供体和载体并连接,供体,载体,- G A A T T C - G A A T T C-,- C T T A A G - C T T A A G-,G A A T T C,C T T A A G,EcoR I,EcoR I,A A T T C

6、- G,G - C T T A A,A A T T C - G,G - C T T A A,- G A A T T C - G A A T T C-,- C T T A A G - C T T A A G-,图. 用二种不同内切酶切开供体和载体后的连接,供体,载体,- G G A T T C - G G A T C C-,- C C T A A G - C C T A G G-,A G A T C T,T C T A G G,BamHI,BgI II,G A T C C - G,G - C C T A G,G A T C T - A,A - T C T A G,- A G A T C C -

7、G G A T C A-,- T C T A G G - C C T A G T-,基因与载体的连接,1. 粘端的连接,2. 平头连接,（1） 供体和载体均平头连接,+,-,-,-,-,T4DNA 连接酶,（2） 粘端变平头后的连接,G A A T T C,C T T A A G,EcoR I,A A T T C- G,G - C T T A A,A A T T C - G A A T T,T T A A G - C T T A A,C - G,G - C,S1酶,Klenow片段,基因与载体的连接,3. 加接头连接,（1） 用接头连接,所需识别的酶,接头序列,BamH I BamH I Ba

8、mH I Bcl I Bgl II Bgl II EcoR I Nco I Pst I,d(CGGATCCG) d(CGGGATCCCG) d(CGCGGATCCGCG) d(CTGATCG) d(CAGATCTG) d(GGAAGATCTTCC) d(CGGAATTCCG) d(CCCATGGG) d(GCTGCAGC),基因与载体的连接,（五）重组体导入受体细胞,1. 转化（Transformation),细胞在一定生理状态（感受态）时可摄取外源遗传物质，并经体内重组，成为其染色体的一部分，导致受体细胞某些遗传性状发生改变。,向受体菌中整合入噬菌体DNA后能导致产生噬菌体颗粒的过程。,2.

9、 转染（Transfection),用各种方法使外源DNA被整合入受体细胞中的过程。,3. 转导（Transduction),（五）重组体导入受体细胞,转染方法,（1） CaCl2 转化法,（2） 电击转化法,（3） 显微注射法,（4） 脂质体,（六）重组体的筛选与表达产物的鉴定,1. 抗药性变化的检测,Tetracycline resistance,Kanamycinresistance,Ampicllinresistance,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,Growth medium + 50g/ml tetracycline,Only cell c

10、ontaining RP4 can grow,All cell can grow,Normal grow medium - no antibody,RP4,2. 原位杂交或区带杂交,转化DNA,以斑点状固定在膜上,杂交分析,电泳分离,固定在膜上,杂交分析,3. PCR 筛选法,存在已知恒定序列,序列两侧作为引物,PCR扩增,电泳鉴定,测序鉴定,外源DNA,三、核酸分子杂交,常用的分子生物学技术,核酸分子杂交,基本原理,高度特异性、高度灵敏性,基因突变、基因序列、疾病诊断等应用,推动分子生物学的发展,膜上印迹杂交,方法,斑点,毛细管虹吸,电转,抽真空,核酸,Southern 印迹法,Nouthe

11、rn 印迹法,（一）探针(probe)的种类及其选择,1. 基因组DNA探针,2. cDNA探针, 选择具有外显子的基因序列， 避免使用内含子及非编码序列, cDNA 中不存在内含子和高度重复序列,（一）探针的种类及其选择,3. RNA探针, 稳定性高，特异性高，效率较高, RNA中不存在高度重复序列, 本底可降低(RNA酶处理),4. 寡核苷酸探针, 人工合成 10-50 bp, 不存在高度重复序列, G:C的含量为40-60 %, 避免内部互补序列,- GACTGAGTC- CTCAG,- GACTGAGTC,-CTCAG, 避免同一碱基连续出现,探针的种类及其选择,（二）各种标记物及其选

12、择,1. 放射性核素标记物,具备的条件,高度灵敏性,标记物与核酸分子结合后不影响特异性,标记物不应影响酶活性,高度特异性及稳定性,（二）各种标记物及其选择,常用放射性核素,32P 能量高，穿透力强，灵敏度高,35S 能量低，灵敏度低,3 H 能量低，散射极少，在感光乳胶上分辨率最高,125 I 能量低，适用于RNA探针的标记，细胞原位杂交,2. 非放射性标记物,各种标记物及其选择,种类,半抗原：生物素、地高辛,配体：生物素,荧光素：FITC,化学发光物：Lightsmith TM II、ECL,（三）核酸分子杂交原理,放射性探针杂交原理,AGTCTAGT,TCGACGAT,UCAGAUCA,*

13、,*,*,*,*,*,*,*,AGTCTAGT,UCAGAUCA,*,复合体,DNA 1,RNA 2,DNA 1,RNA 探针,RNA,暴光,显影,定影,X光底片上黑色斑点,非放射性探针杂交基本过程,DNA探针,HRP酶,结合,HRPDNA复合物,mRNA分子点在膜上,进行杂交,发光自显影,四、 在药物研究中的应用,（四）基因芯片技术的应用,（一）基因修饰的肿瘤细胞,(二） “自杀”基因的应用,(三） 基因治疗,美国开发中的抗癌新药,种类,蛋白疫苗 （K-ras protein vaccine) 腺病毒P53 P53 和RAS疫苗（NCI) C-raf激酶反意抑制剂 （Isis 5132) Ha-ras 反义抑制剂 raf激酶抑制剂 LE-raf-AON 重组治疗疫苗,肺癌、胰腺癌 结肠癌 膀胱、乳腺、肺、肝 卵巢、肺癌、结肠癌 实体瘤 转移性乳腺癌 晚期顽固实体瘤 白血病 肺癌、皮肤癌,肿瘤类型,（四）基因芯片技术的应用,把生物活性大分子（目前主要是核酸和蛋白质）或细胞等，密集排列固定在固相载体上所形成的微型检测器件 检测原理：特异性的分