临床免疫学：CD分子和粘附分子

1、CD分子和粘附分子,主要内容,白细胞分化抗原 分化群(CD分子) 粘附分子 粘附分子异常和临床的关系,白细胞分化抗原,概念：是不同谱系白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。 白细胞分化抗原多属跨膜糖蛋白，分为膜外区、跨膜区及胞浆区三部分。,人白细胞分化抗原,免疫球蛋白超家族（IgSF）,细胞因子受体家族,C型凝集素超家族,整合素家族,肿瘤坏死因子超家族(TNFSF),肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF),按其包膜外区结构特点可分为：,在一个基因组中属于某一群重复顺序的所有基因合起来被称为一个基因 家族(gene family)

2、或多基因家族(multigene family)。一个基因家族的 成员通常位于同一染色体上相互间极靠近的地方。在某些情况下,一些功 能性的或非功能性的家族成员可能会位于别的染色体上，当重复基因在功 能或顺序上变得相互间差异很大时再把它们归成同一基因家族也许就不合 适了。 戴霍夫(Dayhoff，1978)造了一个词:超家族(superfamily)来描绘关系密 切和关系疏远的蛋白质间的联系。据此，在氨基酸水平上相互至少展示出 50%相似性的蛋白质可以被看成是一个家族的成员；而当同源蛋白质展示 出的相似性小于50%时则被看成是一个超家族的成员。 例如a珠蛋白和b珠蛋白被分类在两个不同的家族中，而

3、它们和肌红蛋白一 起则构成了珠蛋白超家族。然而这两术语并不总是能按戴霍夫的标准来严 格地应用的。例如人和鲤的a珠蛋白链仅展现出46%的顺序相似性，这就低 于为归于同一基因家族所划的界限。为此缘故，将蛋白质归类成家族和超 家族不仅要根据顺序的相似性，而且还要考虑关于功能类似性或组织特异 性等方面的辅助证据才能决定。,家族和超家族,受体 MHC分子 协同刺激分子 粘附分子,特异性识别抗原受体 模式识别受体 细胞因子受体 补体受体 NK细胞受体 Ig Fc受体,免疫细胞表面功能分子,CD（cluster of differentiation）分子 概念： 以单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室

4、的单克隆抗体所识别的同一分化抗原称之为CD。,CD分子,参与免疫细胞识别与信号转导的CD分子,参与提供免疫细胞活化的共刺激信号分子,与T细胞识别、粘附、活化有关的CD分子,与B细胞识别、粘附、活化有关的CD分子,CD2,CD2又称为淋巴细胞功能相关抗原-2 （lymphocyte function associated antigen 2, LFA-2）,与其配体LFA-3 ( CD58 ) 结合,CD2分布：胸腺细胞、 T细胞和NK细胞 CD58分布：广泛，T细胞、APC、粒细胞、红细胞和血小板表面，某些上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞也可表达 CD2和CD58分子结构相似，胞外区N端 ：Ig

5、SF V样区，近膜段：IgSF C2样区,CD2/CD58,功能 增强T细胞与APC或靶细胞的粘附作用 促进T细胞识别抗原及其介导的信号转导p59fyn 胸腺细胞的分化成熟,TCR-CD3复合物 是T细胞抗原受体与一组CD3（Gamma DeltaEpsilon Zeta Eta ）分子以非共价键结合而形成的复合物，是T细胞识别抗原和转导信号的主要单位。TCR特异识别由MHC分子提呈的抗原肽，CD3分子转导T细胞活化的第一信号,CD3,是T细胞所特有的表面标志,与 TCR以盐桥形式组成 TCR-CD3复合体,TCR-CD3 复合体结构模式图,转导T细胞活化的第一信号,功能,稳定TCR的结构,负

6、责抗原特异性信号传导,参与T细胞发育,CD4/CD8,CD4：胸腺细胞、成熟TH细胞 巨噬细胞、DC等 CD8：胸腺细胞、成熟TC 细胞 NK细胞、T等,表达,CD4 结构 单链跨膜糖蛋白分子，胞外区含有4个Ig样结构域 分别为D1、D2、D3和D4 CD4分子D1结构域可与HIV gp120结合，是HIV病毒的受体 CD4分子的D4结构域能与IL-16结合，有可能为IL-16受体,IL-16: 刺激CD4T细胞、单核细胞及嗜酸性粒细胞的移行， 抑制HIV感染的T细胞,CD4和CD8共受体分子模式图,CD8结构 或链以二硫键连接的二聚体，每条链具有一个IgV样结构域 V样区与胞膜之间：富含脯氨

7、酸、丝氨酸和苏氨酸的连接肽，广泛糖基化，保护多肽链免于蛋白酶的裂解,CD4通过D1结构域侧面与MHC-II类2结构域结合 CD8通过链V样结构域与MHC-I类3结构域结合 稳定T细胞与APC或靶细胞间的结合 CD4和CD8通过胞浆区的CxCP基序与p56lck酪氨酸激酶相连，参与T细胞活化和增殖信号转导,功能,CD4与MHCII结合位点,CD28-B7分子家族,CD28家族成员包括： CD28 CTLA-4 （cytotoxic T lymphocyte antigen-4） ICOS（inducible T-cell co-stimulator） PD-1（ programmed death

8、 1） CD28家族分子配体均为B7家族分子 均属于IgSF,B7家族成员包括： B7-1（CD80） B7-2（CD86） ICOSL PD-L1、PD-L2,CD28B7分子家族,同源二聚体 胞外区单一IgSF V样结构域，具有高度保守的MYPPY基序 胞浆区可与多种信号分子和激酶作用 胞浆区SH3-激酶结合位点（PYAP），对细胞分化和IL-2的产生重要,CD28,CD28家族分子结构,分布和功能,CD28,分布：组成性表达所有CD4T细胞和50CD8T细胞 功能： 1)与B7结合提供共刺激信号，促进T细胞活化 2)转导信号与TCR转导信号起协同促进作用， 显著减低有效活化T细胞所需的T

9、CR数量,与CD28有31同源性，生物进化十分保守 与B7分子结合必需的MYPPY基序 CTLA-4与B7结合的亲和力明显高于CD28 胞浆区有ITIM（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）基序，与SHP-2蛋白酪氨酸磷酸酶的SH2结构域结合，募集并活化PTP，阻断由PTK参与的活化信号转导通路,CTLA-4 （CD152）（cytotoxic T lymphocyte antigen-4）,分布： 初始T细胞不表达，活化后快速上调表达 与B7结合亲和力高 功能： 转导负调节信号，在调节外周T细胞耐受中发挥重要作用 体内阻断CTLA-4

10、能增强抗肿瘤免疫，加剧自身免疫应答,CTLA-4（CD152）,CD40L（CD154）,结构,属于TNF超家族成员 II型膜蛋白分子，C端在胞外区，N端在胞内区 以三聚体形式结合三聚体的CD40,分布,活化的T细胞表面（主要CD4+T/部分CD8+T和 T） 活化的B细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、单核细胞等,参与免疫效应的CD分子,构成免疫球蛋白Fc受体的CD分子 CD64 （ FcR） CD32 （ FcR） CD16 （FcR） CD89 （FcR） FcR (尚无CD编号) CD23（ FcR） 细胞凋亡相关CD分子 CD95(Fas) CD178（Fas ligand，FasL）,参

11、与免疫效应的CD分子,CD95 (Fas或Apo-1) 与程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）密切相关。 Fas广泛表达于体内许多类型细胞表面。 主要以膜受体形式存在，也可形成可溶性Fas分子。 CD178 即Fas配体（Fas ligand ，FasL） 主要分布于活化的T细胞表面。 FasL亦可分泌或脱落至细胞外，成为可溶性活性分子。,细胞粘附分子,细胞粘附分子（cell adhesion molecule, CAM） 众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合的分子，大多为跨膜糖蛋白,以配体-受体结合的形式发挥作用。 粘附分子与CD分子是根据不同角度

12、来命名 粘附分子是以粘附功能来归类 大部分粘附分子已有CD编号 也有部分粘附分子尚无CD编号,粘附分子的共同特性,大多为跨膜糖蛋白。 粘附分子间是以配体-受体（可互称）相互结合而发挥作用 粘附分子配-受体结合可启动信号转导 其所介导的粘附作用及信号转导均与粘附分子密度及其与配体的亲和力有关。 粘附作用呈可逆性，且非高度特异性。 同一类细胞可表达多种粘附分子，同一类粘附分子也可表达于多种细胞表面。,粘附分子的种类,免疫球蛋白超家族（IgSF） 整合素家族 选择素家族 钙粘素家族（钙依赖性粘附分子）,免疫球蛋白超家族（IgSF）,均具有个或数个Ig样结构域，成员数量庞大。广泛分布于各种细胞，其配体

13、主要是细胞表面的各种粘附分子。主要介导细胞间相互粘附和信号转导，参与机体的免疫应答、炎症和淋巴细胞的分化发育等。,整合素家族,主要介导细胞与细胞外基质的黏附，使细胞得以附着而成整体。,选凝素家族,L-选凝素、P-选凝素、E-选凝素 （Lymphocyte， Platelet ，Endothelial cell） 介导白细胞与内皮细胞黏附、炎症发生和淋巴细胞归巢,选凝素家族,钙离子依赖的粘附素家族,是一类钙离子依赖的粘附分子家族，在维持实体组织形成以及对在生长发育过程中细胞选择性相互聚集、重排有重要作用。 与免疫学关系密切的有E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和P-钙粘蛋白，分别主要分布于上皮细胞、神经

14、细胞和胎盘组织。 配体：自身同型细胞的钙粘蛋白 功能：介导同型细胞间的粘附作用，对组织和器官的发育及完整组织结构的维持起重要作用。,粘附分子的生物学功能,参与免疫细胞的分化和发育 参与免疫细胞识别和活化 参与炎症反应 淋巴细胞的归巢和再循环,粘附分子的生物学功能,参与免疫细胞的分化和发育,粘附分子的生物学功能,参与免疫细胞的识别和活化,粘附分子的生物学功能,参与炎症反应,粘附分子的生物学功能,参与炎症反应,粘附分子的生物学功能,淋巴细胞归巢和再循环,粘附分子与临床,黏附分子与自身免疫缺陷病 黏附分子与自身免疫病 黏附分子与移植排斥 黏附分子与肿瘤,血浆中可溶性粘附分子水平升高与临床疾病的关系,

15、配体和受体相互关系的研究,利用酵母双杂交系统研究蛋白与蛋白相互关系,酵母,A,B,C,酵母双杂交系统的建立基于“真核生物调控转录起始”。,酵母双杂交系统的建立与发展,酵母双杂交系统的建立基于“真核生物调控转录起始”。,酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成，含有881个氨基酸。它有两个结构域： 1、 DNA结合结构域（DNA binding domain, DB ）由位于 N-末端1147个氨基酸构成，能识别位于Gal 1基因的上游激活序列（UAS, upstream activating sequence）,此外， 在其N-端还具有一段核定位序列； 2、转录激活结构域（activation

16、domain, AD）由位于C-末端的768881位氨基酸构成。 当Gal4 的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性.,Yeast two-hybrid system,TRIM5rh Cloned into pGBKT7 with GAL4 DNA-BD,HBV S, C and X and Polymerase Gene Cloned into pACT2 with GAL4 DNA-AD,酵母转录子Gal4分子,激活转录,DB,激活转录,不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。,DB,酵母细胞的Ga14蛋白

17、的DB,AD,大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42,融合,结合到Ga14结合位点,激活转录,Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立,他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型， 将前者与Ga14的DB结构域融合，另一个与Ga14的AD结构域的酸性区域结合。（形成融合蛋白）,Snf1,Snf2,Ga14的DB,Ga14的AD,诱饵 (bait),猎物或靶蛋白 (prey or target protein),如果Snf1和Snf2之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。,这个被激活的、能

18、显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称为报道基因（reporter gene）,X,Y,Ga14的DB,Ga14的AD,诱饵(bait),猎物(prey),报道基因,表达,报道基因的基因产物,通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白之间是否可存在相互作用。,Ga14蛋白 调控的GAL1 序列,-半乳糖苷酶 的LacZ,Field改造LacZ基因，将其整合到酵母菌染色体URA3位上,URA3,URA3,酵母菌的GaL4基因和GaL80基因（ Gal80是Gal4的负调控基因）被缺失,报道基因,表达融合蛋白的载体,URA3,转化酵母菌,URA3,表达-半乳糖苷酶,

19、已知,Ga14的DB,融合蛋白,GENE,DB,X,Y,猎物,诱饵,由X和Y相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。一般地，将DB-X的融合蛋白称作诱饵（bait），X往往是已知蛋白；AD-Y称作猎物（prey），Y称作猎物；整个实验过程称作“狩猎”（hunt或fish）。,K,Ga14的DB,融合蛋白,表达融合蛋白的载体,URA3,转化酵母菌,URA3,同时转化了细胞因子（已知）和 细胞因子的受体（未知）融合表达载体的酵母细胞才有-半乳糖苷酶的活性，单独转化其中任何一个载体都不能检测出-半乳糖苷酶的活性。,表达-半乳糖苷酶,三杂交系统,两个蛋白之间通过第三者发生相互

20、作用。第三物可以是蛋白质、小分子或RNA。,* 通过小分子（配体）相互作用的三杂交系统, 小分子与其受体的相互作用不仅是许多生物学过程的基础，而且在医学领域有重要的价值。Licitra等利用FK506与地塞米松杂合分子，将与LexA-BD融合的糖皮质激素受体及杂合分子作为诱饵，用于筛选与AD融合的Jurkat cDNA文库，分离了与FK506结合的蛋白FKBP12。,1 可溶性细胞因子检测 （ELISA） 2 细胞膜上细胞因子或受体的研究 （免疫组化） 3免疫印迹法 (Western blotting),细胞因子或受体 （抗原）,+,（人）特异性 单克隆抗体 （一抗）,+,酶标的兔（羊）抗人抗

21、体 （二抗）,免疫学检测法检测细胞因子蛋白质的抗原特性,四甲基联苯胺,1,组织切片，细胞涂片 （抗原）,一抗（特异性抗体）,洗涤，辣根过氧化物酶标记的二抗,2 免疫组化 (immunohistochemistry),洗涤，辣根过氧化物酶的底物（邻苯二胺）,底物转化为产物,显微镜下观察,直肠腺癌MDR(+)原位杂交图 直肠腺癌MDR免疫组化图,胃低分化腺癌LMW角蛋白免疫组化图,乳腺癌p53免疫荧光图,3 免疫印迹法 (Western blotting),M,stain,Marker Sample,SDS-PAGE,硝酸纤维膜,聚丙烯酰胺凝胶电泳,+,-,硝酸纤维膜,一抗（特异性抗体）,洗涤，辣

22、根过氧化物酶标记的二抗,底物,Western blot,PAGE (X2),M,M,stain,No-stain,1-3h,_,+,Transfer assemble,brillo pads,Whatman #1 filter,paper,PAGE gel,nitrocellulose,positive electrode,negative,electrode,stain,Immersed in a solution of the antibody,washing,Immersed in a solution of the second antibody,washing,(IgG-HRP),M

23、,M,CD分子和粘附分子及其单克隆抗体的临床应用,（一）阐明发病机制 （二）在疾病诊断中的应用 （三）在疾病预防和治疗中的应用,？,？,？,？,？,？,细胞因子、CD分子、黏附分子基因信息学,Isaac Newton 牛 顿,Prospect 230(4732):1350-4.,Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Cold Spring Harb Symp

24、 Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263-73.,Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection. Kwok S, Mack DH, Mullis KB, Poiesz B, Ehrlich G, Blair D, Friedman-Kien A, Sninsky JJ. J Virol. 1987 May;61(5):1690-4.,Primer-directed

25、 enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Science. 1988 Jan 29;239(4839):487-91.,Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Mullis KB. Ann Biol Clin (Paris). 1

26、990;48(8):579-82.,Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. 1986. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Biotechnology. 1992;24:17-27.,Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sic

27、kle cell anemia. 1985. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Biotechnology. 1992;24:476-80.,PCR经典文献,PCR不只是一个方法改进,Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”； 到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。,

28、PCR的应用领域,生物学领域几乎无处不用,基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测， SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE）,医学领域,疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测）,PCR仪器的变迁,三个水浴锅， 用手移动 （Mullis等人当时用的） 电加热块 自来水冷却 （PE，19

29、88） 电加热块 内置循环液冷却 （PE，1989） 三个加热块 机械手 （Stratagene，1994） 半导体制冷和加热 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler) 风加热 Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR) 中国的状况 1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等） 现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）,耐高温DNA聚合酶的种类,Taq DNA聚合酶 (Thermus aquaticus，Cetus/Roche) Tth DN

30、A聚合酶 (Thermus thermophilus，Toyobo) Pfu DNA聚合酶 （Pyrococcus furiosus，Stratagene） Deep Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Tfl DNA聚合酶 （Thermus flavus，Promega) Tli DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Pwo DNA聚合酶 ( Pyrococcus woesei，Roche) Pfx DNA聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen)

31、Dynazyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme） FD DNA聚合酶 (Thermus sterophilus？，复旦大学) Tma, Tne, KOD, ,PCR相关的术语和产品层出不穷,T-vector HotStart Taq RT-PCR RAPD-PCR DDRT-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Flow chip PCR,TAS Multiplex PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR NASBA Recombinant PCR A

32、FLP SSCP In situ PCR TaqMan/SYBR green,PCR 原理,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,引 物 退 火,DNA 复制,PCR产物生成曲线,logDNA,Cycles,DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2 dNTP ddH2O 耐热聚合酶,PCR标准反应体系,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓度 应适当,过高导致非特异性增加,

33、过低则,扩增产物太少,反应体系对PCR扩增的影响,引 物,pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂,过高非特异性严重 过低无扩增产物,浓度适当 避免反复冻融,pH值适当 避免污染,反应体系对PCR扩增的影响,反应Buffer,Mg 2浓度,dNTP Mixture,ddH2O,反应体系对PCR扩增的影响,热启动 Taq酶,PCR,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,紫外光观察,3-4 小时,PCR产物的检测,PCR具有极高的灵敏度,样品,正对照,负对照,标准分子量,污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。,因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。 用紫外灯破坏污

34、染物也是一个办法,PCR需注意事项,logDNA,Cycles,不同样品有不同的生成曲线,PCR常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,PCR常见问题之一,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对 策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间,现象：正对照有条带，而样品则无；,PCR常见问题之二,非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者