碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究

1、碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究董静 201131301031摘 要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP 在33的丙酮或30的乙醇中溶解，而在50的丙酮或60的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该

2、酶在pH在8-9区间和温度在25-37区间下稳定。关键字：碱性磷酸酶 分离纯化 热稳定性 酸碱稳定性碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3131，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。它

3、是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程1。临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料2-3。研究酶的生物学特性，其之一是它对酸碱度的敏感性， pH对酶活性的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH条件下所表现的活性不同，其表现活性最高时的

4、pH值称为酶的最适pH。pH不仅对酶活性有很大影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响。因为该酶的化学本质是蛋白质，同蛋白质容易变性一样，酶在过酸或过碱的条件下也很容易变性失活。各种酶的酸碱度稳定范围是不同的，这就需要制作酸碱稳定性曲线4。对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。酶反应速度达到最大值时的温度称为酶的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的温度条件下测定酶活力，以温度为横坐标，反应速度为纵坐标，可得到一条温度酶活性曲线。酶的种类和来源不同，对热的稳定性也不同，这就需要通过热稳定性试验测出热稳定范围。一般的试验方法是在一定条件下先将酶在不同的温度

5、下处理一段时间，迅速降温，然后再在一定温度条件下测定酶活力。以处理温度为横坐标，酶反应速度为纵坐标作图，可得到酶的热稳定性曲线，根据这条曲线即可求出酶的热稳定性范围5。抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的统称。它与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，从而引起酶活力下降，这里不包括酶蛋白的水解或变性等情况。在可逆抑制类型中，根据抑制剂、底物和酶三者的相互关系，又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成EIS，其动力学特征是：米氏常数的表观值Km增加，酶的最大反应速度Vm不变。在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和

6、酶结合形成EIS，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特征是：Vm降低而Km不变。在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶结合形成EIS，即Ki=，其动力学特征是：Km和Vm都发生了变化6。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 原料菜市场购买的新鲜猪肝，由本实验室保存。1.1.2 主要仪器 移液管；量筒；玻璃勺浆器(管)；剪刀；离心机（湘仪CenceH2050R）为湖南湘仪实验室仪器开发有限公产品；新华定性滤纸；HH数显恒温水浴锅为金坛市金城国胜实验仪器产品；721型分光光度计（UNIC7200SPECTROPHOTOMETER）为国产分光光度计。1.1.3 试剂0.5mol

7、/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml;0.1mol/L酸钠溶液:8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml;0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠溶液:准确吸取20ml0.5mol/L醋酸镁溶100ml0.14mol/L醋酸钠溶液，混合后定容至1000ml；tris-hcl ph8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/LTris溶液.取100ml10.1mol/LTris溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L醋酸镁溶液100ml，混匀后用1%冰醋酸调ph为8.8，用蒸馏水定容至1

8、000ml；正丁醇、丙酮、95%乙醇；0.04mol/l作用物液：称取10.16g磷酸苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶子内，置冰箱内保存；0.1mol/l碳酸盐缓冲液（ph10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml；碱性磷酸酶液：取纯化的碱性磷酸酶5mg，用ph10缓冲液配制成100ml，放置冰箱内保存;0.5mol/lNaOH溶液;100.3%4-氨基安替比林:称取3g4-氨替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存； 0.5%铁氰化钾：称取10g

9、铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存；基质液：称取磷酸苯二钠2H2O6g,4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中，两液混合并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，于棕色瓶内，用时与等量的水混合即可;各ph值相应缓冲液，0.5mol/LKH2PO4：称取KH2PO46.80g，加水溶解并定容至100ml；0.04M磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠14.3g，溶解于0.1MpH10的碳酸缓冲液中，并用此液稀释至1000ml。1.2 方法1.2.1 提取方法分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下（以下操作均在0-4进行）取新鲜猪肝1

10、0g剪碎（0-4）加0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠60ml，在电动匀浆上匀浆。 肝匀浆体积32.5ml加10ml正丁醇，搅拌3-5分钟后，四层纱布过滤后，离心30min，2500r/min加23.5ml冷丙酮（-10）混匀，冰冻离心2500转5分钟加0.5moL/l醋酸镁20ml，量体积为29ml 滤液23,5ml 上清液（弃去） 沉淀 加96%乙醇12,95ml离心3000转5分钟 悬液 沉淀（弃去） 上清液33.5ml加96%乙醇27.9ml，离心2500转5分钟上清液（弃去） 沉淀0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠20ml溶解，加96%乙醇9.75ml

11、，离心2500转5分钟沉淀（弃去）加96%乙醇24.5ml，离心2500转5分钟 上清液29.5ml上清液（弃去）加0.5mol/L磷酸镁15ml溶解，总体积17.5ml，加99.5%丙酮16.4ml，离心2500转5分钟 沉淀沉淀（弃去）加丙酮7.65ml至50%，离心4000转10分钟 上清液上清液（弃去） 沉淀：加pH8.8Tris缓冲液10ml，分装保存，1ml1管，在-20下保存10管。1.2.2 Km值测定方法 取大试管7支，按表1分别加入相应试剂，加入酶液，混匀之后立即计时，各管在37水浴中准确保温15分钟后，立即加入0.5molNaOH液1.0ml以终止反应；各管中加入0.3%

12、4-氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置10分钟，以0管为对照，在波长510nm下比色，记录各管的吸光度；作图：所测各管的吸光度代表各管中反应速度v，以之为纵轴，以作用物浓度S为横轴，在坐标纸上连接各点作图，以观察曲线的形状。以各管吸光度值的倒数为纵坐标轴，以作用物浓度的倒数为横坐标，作图并求出此酶的Km值。表1 Km值测定曲线制作试剂管号（ml）123456700.04mol/L作用物液0.150.200.250.300.400.600.800pH10磷酸缓冲液0.900.900.900.900.900.900.900.90蒸馏水0.850.800.750.70

13、0.600.400.200混匀37预热5分钟酶液0.10.10.10.10.10.10.10.11.2.3 最适pH及酸碱稳定性实验pH活性曲线的制作 取6支试管，按表2操作，以反应pH值为横坐标，A510为纵坐标绘制pH活性曲线，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适pH值。表2 pH活性曲线制作管号123450反应pH8910111210相应pH缓冲液各加0.5ml酶液各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾之后加）/37预热5分钟预热的基质液各加3.0ml37精确保温15min后各加1,0ml碱性溶液终止反应0.5%铁氰化钾各加2.0mlA510酸碱稳定范围的测定 取6支试管，按表3操作，以pH

14、为横坐标，A510为纵坐标，绘制酸碱稳定曲线，并分析碱性磷酸酶的酸碱稳定范围。表3 酸碱稳定范围曲线的制作管号123450处理pH8910111210相应pH缓冲液各加0.1ml酶液各加0.1ml37保温处理1h0.1MPH10碳酸盐缓冲液各加0.5ml预热的基质液各加3.0ml（0号管基质液在铁氰化钾之后加）0.5%铁氰化钾各加0.2mlA5101.2.4 最适温度及热稳定性实验温度活性曲线的制作 取4支试管，按表4操作，以反应温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制温度活性曲线图，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度。表4 温度活性曲线制作管号1230反应温度（）25378037稀释酶液各加

15、0.1ml（0号管在铁氰化钾之后加）预热复合基质液各加3.0ml分别在不同温度下精确反应15min，各加1.0ml碱性溶液终止反应各加0.5%铁氰化钾2.0ml，静置10minA510热稳定性测定 取4支试管，按表5操作，在上述相应温度的恒温水浴锅内放置相应时间后取出，立即以流动水冷却并置于37恒温水浴锅中预热2分钟，以处理温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制处理时间为15min的热稳定曲线，并分析在本实验条件下碱性磷酸酶的热稳定范围。表5 热稳定范围曲线制作管号1230热处理温度（）25378025热处理时间（分）各15酶液（ml）各加0.1ml（0号管在铁氰化钾之后加）37预热的复合基质各

16、加3.0ml37精确反应15min后各加1,0ml碱性溶液终止反应0.5%铁氰化钾各加0.2mlA5101.2.5 抑制剂类型鉴别 取5支试管，按表6操作，以反应速度倒数1/V或1/ A510为纵坐标，以底物浓度倒数1/S为横坐标，作图，观察直线在纵轴和横轴上的交点位置并计算其K值，与未加抑制时的Km值比较。说明该抑制剂属于何种类型。表6 抑制剂类型曲线制作管号1234040mmol./L底物浓度0.100.150.200.300碳酸盐缓冲液0.90.90.90.90.9蒸馏水0.800.750.700.600.900.25MKH2PO40.10.10.10.10.1混匀，37预热5min酶液

17、0.10.10.10.10.1最终底物浓度（mmol/L）0.10.10.10.10.1按顺序各加1.0ml碱性溶液，1ml4-氨基安替比林，2ml铁氰化钾A5102. 结果与分析2.1 Km值的测定表7 Km值测定实验各管光吸收值管号123456700.04mol/L作用物液0.150.200.250.300.400.600.800光吸收值0.4120.4590.5350.5450.4440.4590.7010图1 Km测定图由图1可知，Km值测定曲线y=3.747 x+1.188,计算出Km值等于3.154mmol/L2.2 最适pH及酸碱稳定性实验2.2.1 pH-活性曲线测定表8 pH

18、活性曲线制作管号123450反应pH8910111210A5100.0070.0110.0380.03600图2 pH-活性曲线由上述数据和图2可知，碱性磷酸酶在本实验条件下的的最适pH值为102.2.2 酸碱稳定范围的测定表9 酸碱稳定范围曲线的制作管号123450处理pH8910111210A5100.1670.1710.1310.01900图3酸碱稳定范围曲线由上述数据和图3可知，碱性磷酸酶在本实验条件下的酸碱稳定范围为pH值8-9，在pH值为9时最为稳定。在高PH下酶的活力受到很大的影响，曲线呈下降趋势。2.3 最适温度及热稳定性实验2.3.1 温度活性曲线表10 温度活性曲线制作管号

19、1230反应温度25378037A5100.1710.2120.0340图4 温度-活性曲线由上述数据与图4可知，碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度为37，温度为80高温时，酶部分失活，曲线下降。2.3.2 热稳定性测定表11 热稳定范围曲线制作管号1230热处理温度25378025A5100.2140.20300图5 热稳定范围曲线由上述表中数据与图5可知，碱性磷酸酶在本实验条件下的热稳定范围为25-37之间，在37时最为稳定，酶活最高，在高温情况下酶不稳定，部分失活，曲线快速下降。2.4 抑制剂类型鉴别表12抑制剂类型曲线制作管号123450最终底物浓度2468160A5100.2530.

20、2870.4030.4940.3960图6 抑制剂类型曲线由图6可知，抑制剂Km值测定曲线y=4.111x+1.985，计算Km值等,2.071mmol/L，与未加抑制剂时的Km值相比较，表明该抑制剂属于反竞争性抑制。3. 结论与讨论3.1 结论通过本实验，可知碱性磷酸酶在本次的实验条件下Km值为3.154，最适pH值为10，在本实验条件下的酸碱稳定范围为pH值8-9，在pH值为9时最为稳定。在高PH下酶的活力受到很大的影响。在本实验条件下碱性磷酸酶的最适温度为37，温度为80高温时，酶失活，酶活下降直至0，碱性磷酸酶在本实验条件下的热稳定范围为25-37之间，在37时最为稳定，酶活最高，在低于最适温度时，酶活很低，随温度的升高酶活随之上升，直到最适温度达到最大，在高温情况下酶不稳定，部分失活，曲线快速下降。此次实验采用的抑制剂类型属于反竞争性抑制。3.2 讨论 此次试验过程中，我们严格按照实验室原则与规范的实验步骤进行操作，纯化后的碱性磷酸酶浓度很高，在后面测定酶学性质过程没有稀释到合适的浓度，导致第一次测出来的吸光度较大，不能很好地处理数据，但是经过有效地稀释跟重复试验后得到了期望的结果，尽管实验过程中注意实验条件的控制，但是仍然有不准确的数据出现，出现了误差，导致做出来的图线性关系不是较好，在之