基因工程实验指导书

1、实验项目 重组质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测实验项目类型：综合性所属课程名称：基因工程实验计划学时：8学时一、实验目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。二、实验原理1、提取质粒原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与

2、蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。2、质粒DNA的酶切鉴定原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。三、实验材料与仪器1、仪器 超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。2、试剂 pGEM-T-AT8载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNa

3、se A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。EcoR I，Xba I， Sac I ，Xho I，内切酶缓冲液（10），10电泳加样缓冲四、操作步骤1、实验准备 氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200mL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2

4、mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），70%乙醇（-20C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121C 30min）。2、操作步骤1）制备质粒DNA（1）在超净工作台中取5ml LB（Amp+）

5、，加入灭菌的摇菌管中。（2）从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌种和pGEM-T-AT8载体菌种（挑白色克隆！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。（3） 取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。（4）在沉淀中加入预冷的100ml 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）（5）加入200ml 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（6）加

6、入150ml 预冷的溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（7）15000rpm离心5min，小心吸取400ml 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800ml 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（8）15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500ml 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净（9）再加入500ml 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃

7、干净（10）离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。（11）加入30ml 无菌蒸馏水或TE缓冲液； 3管pET-his质粒中每管加入10ml蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-his质粒中加入1ml RNaes A。用记号笔标记后放入冰箱中备用。（12）电泳检测2）酶切（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：pGEM-T-AT8（质粒DNA） 6 L10酶切缓冲液（用EcoRI的缓冲液） 2 Ldd water 30 LEcoRI 1LBamHI

8、 1L总体积 40L（2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 L限制性内切酶。（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1-3 h（一般是 37）。（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。（6）酶切后

9、的质粒可以回收备用。（7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。五、实验报告 六、思考题泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？实验项目 -半乳糖苷酶基因（lac Z）的定点突变实验项目类型：基础性所属课程名称：基因工程实验计划学时：6学时一、实验目的 1. 学习并掌握利用PCR进行基因缺失和插入定点突变的基本原理和实验方法。 2. 复习碱法小量制备质粒DNA的原理和方法。 二、PCR介导的基因定点突变的基本原理 载体pSV-半乳糖甘酶大小是6820bp（图实验1-1），其上带有完整的lacZ基因，其中lacZ基EDTA因的起始位点是710bp，终止位点（TAA）是3755bp.通过改变5端引

10、物或（和）3引物中的核苷酸序列或数目，可 利用多聚酶链式反应（PCR）进行基因的定点突变。本实验的 定点突变均设计在5端引物上，而3端引物上（4279-4302bp）无突变。其中一条突变的5端引物上插入了TCC3个核苷酸，这条引物位于3880-3901bp,PCR扩增后得到的，插入突变DNA片段长度是425bp。另一条突变的5端引物上缺失了TAC3个核苷酸，这条引物位于3874-3901bp，PCR扩增后得到的缺失突变DNA片段长度也是425bp.pSV-半乳糖甘酶质粒插入突变的5端引物（下划线是插入的核苷酸）：P5c：5 A GCC TAC TCC TTC CCG TTT TTC CCG 3

11、 缺失突变的5端引物（虚线是删除的3个核苷酸）：P5q：5 C ATG GGA GCC- TTC CCG TTT TTC CCG 3 3端引物：P3：5GTG CGG GCC TCT TCG CTA TTA CGC 3TCC3851 TTCTTTTTCT TTTACTTTTT TATCATGGGA GCC TTCC CGTTTTTCCC3901 GATTTGGCTA CATGACATCA ACCATATCAG CAAAAGTGAT ACGGGTATTA3951 TTTTTGCCGC TATTTCTCTG TTCTCGCTAT TATTCCAACC GCTGTTTGGT4001 CTGCTTTC

12、TG ACAAACTCGG AACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAATGGTTAC4051 AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT TTTTTTCACT4101 GCATTCTAGT TGTGGTTTGT CCAAACTCAT CAATGTATCT TATCATGTCT4151 GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC AAGCTGGCAC TGGCCGTCGT4201 TTTACAACGT CGTGACTGGG AAAACCCTGG CGTTACCCAA CTTAATCGCC4251 TTGCAGCACA TC

13、CCCCTTTC GCCAGCTGGC GTAATAGCGA AGAGGCCCGC4301 ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGAATGGCG AATGGCGCCT lacY 3809-4011突变的PCR扩增产物的DNA序列图5引物5引物3引物3引物PCR介导的插入突变和缺失突变示意图三、实验材料与仪器1、质粒：pSV- -半乳糖苷酶；菌株：大肠杆菌JM109菌株。2、溶液或试剂：LB液体培养基，溶液I， 0.4N NaOH，2%SDS，溶液III，无水乙醇，70%乙醇，氯仿，Tris-HCl饱和酚，TE缓冲液，TAE缓冲液。琼脂糖等。3、仪器或其他用具：

14、恒温振荡培养箱，恒温培养箱，制冰机，台式离心机，超净工作台，PCR仪，电泳系统，凝胶成像系统，微量移液器，吸头等。四、操作步骤 1、菌体的培养 挑取含有pSV- -半乳糖苷酶质粒的大肠杆菌接种于LB培养基中，37振荡培养过夜。2、 质粒DNA的提取 从平皿上挑取单克隆接入2ml含Amp的LB（100g /ml）培养液中37过夜振荡培养。 转移约1.2ml过夜培养物到1.5ml离心管中，10，000rpm离心1min，弃上清后，再离心5s，吸去剩余上清。 每个离心管中加入预冷的溶液100L，在混合器上振荡使菌体充分悬浮、分散、混匀。 每管加200L新配制的溶液，缓慢倒转几次混匀，冰上放置5min

15、，使细胞膜完全裂解。 每管各加150L预冷的溶液 ，倒转几次混匀混匀，冰上放置10min,此时酸碱中和，质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不溶性复合物，同时钾盐使游离的SDS沉淀。 12，000rpm离心10min，沉淀染色体DNA及不溶的变性蛋白，取上清。 上清液用等体积的Tris-HCl饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次。 上清液用等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次。 上清液用2倍体积的无水乙醇沉淀30min以上。 12，000rpm离心10min 去上清，用1ml70%乙醇洗涤沉淀一次，离心去上清后空气晾干。 每管加20L含RNase（20g /ml）的TE

16、缓冲液溶解后，37消化30min以水解RNA。 取2ul电泳检测提取的量。其余的20保存备用3、PCR扩增前的准备在两个PCR管中，分别加入以下组分：载体pSV-半乳糖甘酶（2.5ng/L） 1L10PCR反应液 2.5LMgCl2 (25mmol/L) 1.5LdNTPs各（2.5 mmol/L） 2L3末端引物（20mol/L） 1L插入突变（或缺失突变）5端引物（20mol/L） 1LTaqDNA聚合酶（1U/L） 1L重蒸馏水 15L总体积 25L混匀后放入PCR循环仪。（添加一个试剂时，要使用新的无菌吸头，不要污染无菌贮液。）4、PCR循环按下列.PCR反应程序进行PCR循环94.

17、3min94. 30S55 30S 循环30次72 30S72 10 min 4保存。5、琼脂糖凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶制备：配制1.0%的琼脂糖凝胶。（2）上样：取5L扩增产物加入1L6上样缓冲液，将6L样品加入样品槽中。（3）电泳：恒压80，待染料迁移到前沿时停止电泳。（4）染色和电泳结果的观察：将凝胶在EB染色液染色15分钟后在紫外透射仪中观察染色的条带（若条带不清楚，可在EB染色液继续染色）。（其余的PCR扩增产物保存在-20，等待电泳结果，再做下一步实验，见实验二）五、实验报告 分别绘出你所提取的质粒DNA的电泳图谱和PCR产物的电泳图谱。 六、思考题 1、 你的PCR产物是否与预期

18、的大小一致？为什么有的电泳图片上除了目的基因的特异性条带外，还有其他的条带出现？实验项目 外源目的基因片段与载体的体外连接实验项目类型：基础性所属课程名称：基因工程实验计划学时：6学时一、实验目的 通过本实验掌握利用T载体克隆PCR产物原理和方法，掌握重组DNA分子的构建方法。二、PCR产物克隆的基本原理 利用Taq DNA 聚合酶催化的PCR 扩增产物两端带有非特异性延伸的腺苷酸A，将PCR扩增获得的-半乳糖苷酶（lacZ）基因定点突变片段与pGEM-T载体两端突出的T接头，在T4 DNA 连接酶作用下环化，载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。三、实验材料与仪器

19、1、克隆载体pGEM-T Easy；菌株：大肠杆菌JM109菌株；突变的lac Z 基因片段；X-gal，IPTG，氨苄青霉素（Amp）等。2、溶液或试剂：LB液体培养基，0.1MCaCl2，20mg/ml X-gal，200mg/ml IPTG，100mg/ml Amp溶液。3、仪器或其他用具：恒温振荡培养箱，恒温培养箱，制冰机，台式离心机，超净工作台，微量移液器，吸头，平皿，涂布器等。四、操作步骤 PCR产物与pGEM-T载体直接连接： （1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1416C。（2） 取一个灭菌的1.5ml微量离心管，加入：4ml PCR 产物混合液1ml pGEM-

20、T载体 0.5ml T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）1ml 连接酶缓冲液3.5 ml dd Water总量 10ml 体系（3）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16C金属浴水中连接3个小时。（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。五、实验报告六、思考题 连接酶的最适温度室多少？实验项目 感受态菌的制备实验项目类型：基础性所属课程名称：基因工程实验计划学时：6学时一、实验目的学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。二、实验原理 细菌在0C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。三、实验材料与仪器1、仪器 旋

21、涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。2、试剂 E. coli JM109，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water四、操作步骤 1、实验准备1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），冰冷的0.1 mol/L MgCl2溶液（灭菌），无菌dd Water，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。2、

22、操作步骤 （1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）培养基。（2）从超低温冰柜中取出DH5a菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37摇床培养过夜。（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养23h，测定OD590为0.375（0.40.6，细胞数108/mL，此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。（4）将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000rpm离心10min。（5）将离心管

23、倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置20min。（6）4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/L MgCl2溶液垂悬，插入冰中放置20min。（7）4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200L 冰冷的0.1 mol/L MgCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100mL分装到1.5mL离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80超低温冰柜中保藏（可存放数月）。（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。五、实验报告六、思考CaCl2溶液的作用是什么？实

24、验项目 重组DNA分子转化及克隆菌落的筛选与鉴定实验项目类型：基础性所属课程名称：基因工程实验计划学时：6学时一、实验目的 掌握蓝白斑筛选的原理和实验方法二、实验原理 DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。转化受体菌JM109感受态细胞，于LB/Amp/X-gal/IPTG平板上培养，用蓝/白斑实验初步筛选重组转化体。如果外源片段插入lacZ引起插入失活，则产生无活性的-半乳糖苷酶，不能利用X-gal，形成白色菌落，如果载体自连，则产生有活性的-半乳糖苷酶，分解X-gal形成蓝色的菌落，从而一次筛选出含有重组子的转化细胞。三、实验材料与仪器1、仪器 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温