生命科学综合实验报告zz

1、生命科学综合实验报告名称：绿色荧光蛋白基因的原核克隆与表达 姓 名： 蔡晓丽班 级： 生082-1学 号： 1组 别： 一组实验台号： 一指导教师： 曾勇实验日期： 2011/11/142011/11/17同组成员： 张瀚林 严凤莲 许慧 孙伟伟 绿色荧光蛋白基因的原核克隆与表达一 实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二 实验原理pET原核表达系统,目的基因被克隆到 pET质粒载体上，受T7启动子控制

2、；T7启动子受宿主细胞编码的T7 RNA聚合酶控制；宿主T7 RNA 聚合酶基因位于乳糖操纵子中，具有可调控性。将外源基因克隆在含有T7启动子的pET23b(+)表达载体中，让其在E.coli(BL21DE3)中表达。先让宿主菌生长，然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖 )或乳糖，（IPTG与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使乳阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用， ）使宿主菌染色体上的LacUV5启动子指导的T7RNA聚合酶基因转录，再与表达载体上的T7启动子结合，启动表达载体上外源DNA基因大量转录

3、并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE检测。三 实验仪器与试剂仪器： 超净工作台、PCR仪、核酸电泳设备、灭菌锅、培养箱、恒温摇床、微量移液器、核酸蛋白图像分析仪、离心干燥仪、低温离心机、常温台式离心机、微量分光光度计、水浴锅、微波炉、金属浴、涡旋仪、掌中宝离心机等试剂： 质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒、高效感受态制备试剂盒、T4连接酶、NheI、XhoI、Taq酶、氨苄青霉素（Amp）、IPTG、Goldview、核酸分子量标准、核酸电泳试剂、细菌培养用培养基四 实验步骤第一天一、实验药品的配制1 根据LB培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L；酵母提取物(Yeas

4、t extract) 5g/L ，氯化钠(NaCl) 5g/L 另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4，固体培养基加入琼脂粉20g/L 。2 含Amp LB固体培养基的配制：准备500ml锥形瓶1个，配制LB固体培养基250ml。121灭菌20min。待培养基冷至60左右（以不烫手背为标准），加入Amp(50mg/ml)300l至终浓度为60g/ml，倒平板备用。3 液体LB培养基的配制：配制LB液体培养基100ml：4 10TBE（89mM Tris碱，89mM硼酸，2mMEDTA）Tris碱加108g，硼酸加55g ，Na2EDTA2H2O加7.44g，水加至1000m

5、l5、牙签，枪头、（1.5ml，10ml）离心管、PCR管等灭菌，准备试管20个，每支分装5ml。121灭菌20min，备用（老师准备）二 PCR反应体系准备20l 反应体系：（每组3份） 上游引物（2M）： 2l下游引物（2M）： 2ldNTP（2.5mM） ： 2l10buffer ： 2lMgCl2 ： 1.2lTaq酶(5u/l) ： 0.4l模板 ： 1l水 ： 9.4l按上述体积比例用不同规格移液枪按体积数由大到小依次添加到放入PCR仪里设定反应条件反应3-4小时。三 琼脂糖凝胶电泳测PCR反应产物浓度称取0.16g琼脂糖，加入16ml 0.5TBE缓冲液，微波炉加热融化。稍冷后加

6、入1l Goldview，倒胶，室温冷却15-20min。2、每5l PCR产物中加入1l 6loading buffer，上样，电泳。3、核酸蛋白图像分析仪上观察电泳结果，目的基因约750bp。三、双酶切、用微量分光光度计分别测定PCR产物和表达载体pET23b的浓度。2、双酶切：GFP的双酶切位点是NheI与XhoI，其中NheI在buffer M中的酶切活力最高，而XhoI在buffer H中的酶切活力最高。NheI2ul10倍bufferM5ulDNA103ulH2O32.7ul37摇床上进行酶切待反应6h左右Tris-cl2ulNaCl1.25ulXhol1ul加入以上成分调至buf

7、fer H，这样便达到XhoI酶的最适缓冲液浓度，然后放回37摇床上进行酶切，过夜。原核表达载体pET23b（1ug）同GFP双酶切步骤一样第二天一、酶切片段的回收及连接1、酶切样品的纯化：（小量DNA产物纯化试剂盒ZP201-2，北京庄盟 ） PCR反应结束后，将PCR产物移至干净的1.5ml 离心管中，加入5倍体积的结合液混匀。其它酶切样品也照同样比例加入。 将混合液转移到收集管内的吸附柱中，室温放置 2分钟。12,000rpm室温离心 1分钟。 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，加入700l 漂洗液W2，12,000rpm室温离心 1分钟。重复步骤 4一次。 取

8、下吸附柱，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，12,000rpm室温离心2分钟。 将吸附柱室温自然干燥10分钟，挥发剩余酒精，利于DNA回收。 将吸附柱放入一根新的 1.5-ml离心管中，在柱子膜中央加 40l水（pH=8.5），室温或37放置5分钟。 提高洗脱温度到60左右有利于提高DNA的洗脱效率。 12,000rpm室温离心2分钟，离心管中的液体即为回收的 DNA 片段，可立即使用或保存于-20备用。 2、微量分光光度计测定DNA浓度。载体的浓度=23.2ng/ul PCR的产物=55.1ng/ul23.2ug/ul*35ug/ul=812ug55.1ug/ul*35ul=1

9、928.5ug浓缩体系：812/9=90.2ug/ul载体：200ug/90.2ug/ul=2.2ul3、样品浓缩：将样品浓缩至5ul左右。4、目的基因片段与表达载体的连接目的基因=载体的量*目的基因的长度*3载体的长度pET23b载体约3.7kb，目的基因约800bp。连接体系中载体约200ng目的基因=200*0.8*3/3.7=130ng10l连接体系：T4连接酶 1l10buffer 1l载体（双酶切pET23b） 200ng目的基因（双酶切GFP） 130ng加超纯水 补足体积至10l16连接4-5h。二、重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞1、离心干燥仪浓缩样品：将连接样品浓缩至

10、3l左右。2、将样品置于冰上冷却3-5min。加入30l BL21感受态细胞，冰上静置30min。3、42水浴热击60s，冰上静置2min。4、加入170lLB液体培养基，37 200rpm培养45min。5、吸取所有菌悬液涂布两个含 Amp的LB平板，37培养过夜。第三天一、重组绿色荧光蛋白基因的检测-PCR检测目的基因：1、平板上挑取菌落进行PCR扩增（每组8个）：81l 反应体系：上游引物（2M） 9l下游引物（2M） 9ldNTP （2.5mM） 9l10buffer 9lMgCl2 5.4lTaq酶 (5u/l) 18.6l水 37.8l上游引物：T7 Pomotor Primer：

11、5 TAATACGACTCACTATAGGGCGA 3下游引物：T7 Terminator Primer： 5GCTAGTTATTGCTCAGCGG 3PCR条件：94 5min94 30s52 30s 35个循环72 1min72 10min4 保存2、电泳检测PCR结果称取0.16g琼脂糖，加入16ml 0.5TBE缓冲液，微波炉加热融化。稍冷后加入1l Goldview，倒胶。每10l PCR产物中加入1l 10loading buffer，上样，电泳。核酸蛋白图像分析仪上观察电泳结果，目的条带约900bp左右。电泳图如下：第一条未出现条带，样品在电泳过程中被冲散丢失3、阳性菌落的扩增培

12、养挑取阳性菌落接种LB液体培养基（含Amp），37培养过夜。4、对照菌落的扩增培养取冻存的BL21（含pET23b空载体）细菌接种LB液体培养基（含Amp）， 37培养过夜。第四天一）绿色荧光蛋白基因的诱导表达1、上午10点，加入诱导剂IPTG（100mM）20l終浓度0.4mM ，继续培养3-4h，下午2点，紫外线下观察结果。（二）质粒的提取：上海生工质粒提取试剂盒1、将过夜培养的12ml细菌12,000rpm离心1min，彻底去除上清。2、加入250l BufferP1 ，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。3、加入250 l BufferP2，立即温和混匀（倾斜45度角，顺一个方向，慢旋转离心管

13、），使细菌裂解，室温放置2-4min。注意：不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染。4、加入350l BufferP3，立即上下颠倒510次，使之充分中和，室温放置2min。5、12,000rpm，离心5min。6、将步骤（5）中上清转移到套放于2.0-ml收集管内的UNIQ-10柱中，8,000rpm室温离心1min。注意：不要吸取沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。7、弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500l Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000rpm室温离心1min。8、重复步骤（7）。9、弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入

14、同一支收集管中，10,000rpm室温离心1min以彻底去除Wash Solution。10、将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5-ml离心管中，加50lElution Buffer，室温放置2min后，10,000rpm室温离心1min。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。提高洗脱温度到5580有利于提高DNA的洗脱效率。微量分光光度计测定质粒浓度结果如下：质粒浓度=202.0ng/ul A260/A280=2.09五、实验结果分析与思考1、第一天扩增进行PCR扩增目的基因，均克隆成功，PCR产物进行微量分光光度检验样品纯度较其他组值小，可能原因是PCR过程中的样品放置出现疏漏，离心管盖子未完全，PCR仪器放置位点也可能造成影响。2、第三天实验，电泳阳性克隆时，全部样品失败，分析原因可能是由于电泳胶面倾斜导致样品悬浮，电泳时样品跑到电极缓冲液中，最后在图像分析仪上看不到结果。3、最后收集得阴性质粒浓度未达到最佳，可能是操作过程存在一定问题。在这次实验中熟练掌握和主要学习了分子生物学相关的原理和操作技术，比如，PCR技术，DNA片段的酶切、连接和回收，细菌转化，阳性克隆的筛选，质粒的提取，核酸电泳，蛋白的诱导表达等，了解了利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程和方法，掌握了选择表达系统和引物设计的方法。通过四天的实验学到很多，首先做任何实验都需要我们认真仔细，多思考，