基因工程育种微生物遗传育种演示课件

1、1,1,第五章 基因工程育种Genetic engineering,基因工程是将不同生物的基因在体外人工剪切组合，并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。,2,2,奠定基因工程的三项关键技术 DNA的特异切割 Smith 和Nathans 获1978年诺贝尔医学奖 DNA的分子克隆 Berg（1972）将猴病毒SV40 DNA与噬菌体基因融合，成功构建重组DNA； Cohen 和Boyer （1973）将质粒pSC101与R的tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli，首次实现了DNA的分子克隆。

2、DNA的快速测序 Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法DNA快速测序技术 1980年诺贝尔化学奖：Berg, Gilbert, Sanger,3,3,分离或合成基因； 通过体外重组将基因插入载体； 将重组DNA导入细胞； 扩增克隆的基因； 筛选重组体克隆； 对克隆的基因进行鉴定或测序； 控制外源基因的表达； 得到基因产物或转基因动物、转基因植物,基因工程操作的主要步骤,4,4,第一节 基因克隆的酶学基础,一、限制性核酸内切酶restrictive endonuclease 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂

3、的酶。 核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase) 核酸外切酶：exonuclease 核酸内切酶：endonuclease,5,5,1、寄主控制的限制与修饰作用 （1）寄主控制的限制作用(Restriction) 作用：破坏外源DNA，使之迅速降解 机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进 行切割 （2）寄主控制的修饰作用(Modification) 作用：保护自身的DNA，使之不受限制 机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到 限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。,6,6,2、限制性核酸内切酶的类型,7,7,3、限制性核酸内切酶的命名 用产生菌的属名一个字母(大

4、写，斜体)种名两个字母(小写，斜体)菌株名一个字母编号（罗马数字） 例 EcoRI, EcoRII：从E.coli Rye13菌株中获得 HindI，HindII，HindIII：从Haemophilus influenzae d菌株获得,8,8,4、型限制性核酸内切酶的基本特征 （1）识别序列：一般48bp，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构 ( palindromic structure ) 例：AluI：5-AGCT-3 AsuI：5-GGNCC-3 PstI： 5-CTGCAG-3,9,9,（2） 切割： 产生平末端：SmaI,5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5,产生3-OH单

5、链粘性末端: PstI,5-C TGCA G -3 3-G ACGT C-5,产生5-P单链粘性末端: EcoRI,5-GAATT C -3 3-C TTAA G-5,10,10,11,11,酶剪切条件,需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。 辅助条件：DTT、牛血清蛋白。 抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓度。 其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。,12,12,狭义：来源不同但识别和切割相同序列的酶。 Hpa与MspI: CCGG 广义：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同 异功酶（neoschizomer）：SmaI和

6、XmaI，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末端，后者切后产生粘性末端。,（3）同裂酶 ( isoschizomers ),13,13,两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶 BamHI: GGATCC Bgl：T GATCA,（4） 同尾酶 ( isoocaudamer ),14,14,二、DNA连接酶（DNA ligase ） 催化两个双链DNA片段相邻的5-P与3-OH之间形成磷酸二酯键。 1、体外DNA连接 连接具有互补粘性末端的DNA片段 连接具有平末端的DNA片段 先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，再行连接,15,15,2、连接

7、用酶 （1）T4 DNA连接酶： 催化反应需要Mg+2, ATP 催化粘性末端连接，效率较高 催化平末端连接 （2）大肠杆菌连接酶 催化反应需要NAD+ 只能催化粘性末端的连接,16,16,减少载体自身连接的方法： 脱磷酸； 双酶切,17,17,三、反转录酶 (reverse transcriptase) 催化以mRNA为模板的cDNA的合成 cDNA（complementary DNA）： 互补于mRNA的DNA片段,18,18,Reverse transcription,19,19,四、末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase) 催化将脱氧核苷

8、酸连接至DNA分子末端的3-OH上 向3-单链末端上连接：Mg+2 向平末端上连接：Co+2 五、Taq DNA聚合酶 来源：栖热水生菌 Thermus aquaticus,20,20,第二节 基因的克隆载体(cloning vector),克隆载体：以繁殖DNA片段为目的的载体 克隆载体的基本要求 在细胞中能进行自主复制，为松弛型; 具有多种限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入，并且插入后不影响载体的复制; 容易进入宿主细胞，进入效率越高越好，并且容易从宿主细胞中分离纯化出来，以便于重组操作; 具有可供选择的遗传标记,21,21,一、质粒载体 1、质粒的一般生物学特性 (1)环状双链质

9、粒DNA的构型 共价闭合环状DNA(cccDNA):两条链均保持完整的环状构型，通常呈现超螺旋的SC构型 开环DNA(ocDNA)：一条链保持完整的环状结构，另一条链出现有一至数个缺口，即OC构型 线形DNA(l DNA)：质粒DNA经过适当的限制性核酸内切酶的切割后，发生双链断裂，称L构型,22,22,23,23,(2)表型效应 性别：F，SCP1 抗生素类物质合成：SCP1，Col 抗药性：R 分解性质粒：CAM(樟脑)，TOL(甲苯) 酶的合成：Rye13 隐蔽性质粒(cryptic plasmid)：2m,24,24,(3)质粒的分类 分子量： 大型质粒：MW40106d 小型质粒：M

10、W10106d 复制类型 严紧型质粒(stringent)：13 copies/cell 松弛型质粒(relaxed)：1060, or more,25,25,接合类型 接合型质粒(conjugative) 非接合型质粒(nonconjugative) 质粒的不亲和性(incompatibility) 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。 同一不亲和群：不能共存于同一细胞中 不同的不亲和群：能共存于同一细胞中,26,26,(4)质粒的命名 质粒名以三个英文字母加阿拉伯数字表示,27,27,为了说明质粒的来源、性状，有时需要标出缺失、插入等

11、 pXY9109：FDtraA3(63.1-64.0kb) pXY2101：pXY101W40kb:k12hisA:1.5kb (5)与质粒有关的菌株的命名 E.coli k12: E.coli C600：k12(F-)(l-)thr leu tonA lacY thi E.coli XY100：C600(F155)(pXY1234),28,28,2、质粒克隆载体 （1）特性 具有独立复制起点; 具有较小的相对分子量（1200kb）, 克隆外源DNA片段一般不超过15kb； 具有较高的拷贝数（10200）； 具有便于选择的标记； 易于导入细胞； 具有安全性,29,29,（2）克隆质粒载体,30

12、,30,31,31,质粒分离的步骤：,粗提,精提,32,32,氯化铯梯度离心法： 有效地去除蛋白质、RNA、染色体DNA、受损质粒。,33,33,二、l噬菌体克隆载体 1、优点 遗传学背景十分清楚 载体容量大，23kb 具有较高的感染效率 2、类型 插入型载体:较小片段DNA的插入（10kb以内）； 取代型载体：较大片段DNA的插入； 重组DNA分子大小为l噬菌体DNA的75105；野生型DNA为 48kb，噬菌体的包装上限是 51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。,34,34,插入型载体,35,35,取代型载体,36,36,3、 l噬菌

13、体克隆载体的导入 转染：用重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。 效率低：未经任何基因操作处理的新鲜制备的DNA，其典型的转染效率也仅为 105106噬菌斑/微克DNA，体外连接的结果，转染效率便下降到了104103左右。 DNA的体外包装：在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒，形成有感染功能的病毒载体。,37,37,三、柯斯质粒载体(cosmid vector) 由l噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，来自l噬菌体粘性末端的DNA片段（cos位点）。,38,38,优点 具有l噬菌体的特性，在体外包装后具

14、有噬菌体的高效感染力； 具有质粒DNA的复制方式； 具有克隆大片段外源DNA的能力(45kb)； 具有与同源序列的质粒进行重组的能力,39,39,柯斯克隆（cosmid cloning） 应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术,40,40,第三节 基因工程的基本操作,一、目的基因的获得 1、从供体细胞的DNA中分离 （基因文库的构建） 基因文库：某生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。 如“鸟枪法”(Shotgun Method),41,41,步骤 提取染色体DNA 限制酶解 电泳分离 与载体连接 导入宿主 筛选阳性克隆,42,42,2、从mRNA合成cDNA (

15、cDNA文库构建） 所谓cDNA文库是指某生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。,43,43,步骤 提取mRNA 反转录合成cDNA第一链 合成cDNA第二链 与载体连接 导入宿主细胞 筛选阳性克隆,44,44,3、PCR体外扩增目的基因 PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链式反应：利用特殊的DNA聚合酶，在体外扩增位于两段已知序列之间的特定DNA区段的方法。 (1) PCR组成： 含目标DNA序列的模板DNA 寡核苷酸引物 DNA聚合酶：Taq 或 Pfu dNTPs 缓冲体系和金属离子,45,45,(2) PCR过程 变性( denaturation)：90

16、以上 退火( annealing)：4060 延伸(extension)：72 如此进行2040 个循环，DNA量扩增106107倍。,46,46,47,47,48,48,4、基因的化学合成 主要应用于已知核苷酸序列的、分子量较小的基因的制备。 通常先合成一定长度的具有特定序列的寡核苷酸片段，然后再组装成完整的基因。 方法主要有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自动化法等。,49,49,二、目的DNA与载体的连接 1、粘性末端连接 2、平齐末端连接 3、同聚末端连接 4、人工接头连接,50,50,三、重组DNA导入宿主细胞,1、转化或转染 2、体外包装与感染 3、电穿孔法el

17、ectroporation 常用宿主系统,51,51,过程：连接反应的混合液+感受态细胞; 冰浴10至30分钟; 热休克0.5至2分钟; 加入培养基37C振荡培养1小时; 涂布平板，培养。,52,52,四、重组体的筛选与鉴定 1、遗传学方法：检测选择性标记 2、核酸杂交方法：检测目的基因 3、免疫化学方法：检测目的基因产物 4、直接检出法：检测目的基因产物,53,53,五、DNA序列测定 Sanger双脱氧链终止法 1、试剂 引物 模板：待测序DNA DNA聚合酶 dNTPs ddNTP,54,54,2、测序反应 3、制备聚丙烯酰胺凝胶 3、凝胶加样 4、电泳 5、结果记录与分析,55,55,

18、56,56,57,57,六、外源基因的表达 影响表达的因素 细胞中基因拷贝数：拷贝数多，产物多 转录水平：启动子与RNA多聚酶的统一 翻译水平：mRNA的核糖体结合部位与宿主核糖体的统一；密码子与tRNA的统一； mRNA的稳定性 外源基因的插入方向 转录后的修饰及翻译后的修饰,58,58,第四节 基因工程的实际应用,微生物发酵 病毒疫苗 哺乳动物蛋白（人源蛋白药物） 转基因动植物 环境生物技术 基因诊断与基因治疗 蛋白质工程（定点突变、定向进化） 代谢工程,59,59,复习题 1、何谓基因工程？基因工程操作主要步骤。 2、何谓限制性核酸内切酶？型限制性核 酸内切酶有何特点？ 3、克隆载体的基

19、本要求。 4、质粒的表型效应、分类、命名。 5、目的基因的获得途径 6、名词：基因文库、cDNA文库、PCR、 质粒不亲和性,60,60,插入钝化/失活（insertional inactivation) 由于外源DNA插入到某一基因内而使其功能丧失的现象。 受体细胞是Amp、Tet的敏感型 在Amp+Tet培养基上生长的是野生型质粒 只在Amp培养基上生长的带有重组质粒,选择性标记筛选,61,61,b-半乳糖苷酶显色反应（蓝白斑筛选） -半乳糖苷酶能将无色底物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的5-bromo-4-chloroindigo，菌落呈蓝色 宿主基因合成的是缺失N-末端1141氨基酸的缺陷型酶，无活性 pUC系列等质粒具有lacZ基因，所编