第七章PCR技术

1、第七章 PCR技术 Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 PCR的最早设想 ： 1971年，Korana最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”。 PCR的实现：1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis等人发明了PCR，又称为基因的体外扩增法。 1985年公开报道 1987年PCR得到美国的专利权 1989年PCR技术被“Science”杂志评为十大科技新闻之一 1993年Mullis因发明了PCR而获得诺贝尔化学奖第一节 PCR技术的基本原理一、

2、PCR技术的基本原理依据体内DNA的半保留复制机理及DNA分子在不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成两条单链DNA，单链DNA用4种dNTPs在引物和DNA pol的作用下合成新生的DNA互补链。二、PCR扩增过程1、高温变性 在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA 变性温度： 94-97，常95 30-50s，常30s2、低温退火 当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物与其互补的模板在局部形成杂交链。 退火温度： 25-60，常55 60-90s，常60s3、适温延

3、伸 在DNA pol和4种dNTPs底物及Mg2+存在的条件下，pol催化以引物位起点的DNA链的延伸反应 延伸温度： 70-74，常72 60-120sPCR的反应动力学 理论上为2n。 30次循环，DNA产量达109拷贝 实际上为(1+R)n。R为扩增效率，平均为75% 30次循环，DNA产量实际为106-107拷贝三、PCR技术的特点 高度的敏感性 高度的特异性 操作简便、快速 适用样品的广泛性第二节 PCR反应体系中的各组分分析一、引物 引物的设计决定PCR反应的成败 PCR的效率和特异性取决于：1、引物与模板的特异结合2、聚合酶对引物的有效延伸引物设计原则1、引物长度以16-30为宜

4、 引物过短，特异性降低 引物过长，成本增加，PCR的最适延伸温度会超过Taq DNA pol的最适温度 若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。人大约有43000个可能的结合位点 若引物长16bp，则平均每隔416=4.29109bp有一个结合位点。2、引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜4、碱基分布的随机性：ATGC随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列。尤其是引物的3端，不应有连续3个G或C5、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生

5、非特异的扩增条带。6、两引物之间不互补，一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体7、引物3端是引发延伸的点，不应错配：由于ATGC引起错配有一定规律，以引物3端A影响最大，因此，3端的末位碱基最好选TCG，而不选A。8、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源9、引物5端可以修饰 加酶切位点； 用生物素、荧光物质、地高辛等标记； 引入突变位点； 引入启动子序列； 引入蛋白质结合序列 5端修饰后不影响正常的PCR反应引物的保存和使用浓度 冻干，-20，可保存1年，常保存6月 使用最终浓度：0.2-1.0mol/L

6、，适宜 小于0.2mol/L，影响产量 大于1.0mol/L，不经济，出现非特异性扩增产物和引物二聚体二、DNA Pol Mullis最初使用的DNA聚合酶是E.coli DNA pol I 的Klenow片段 缺点：1、Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。2、引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA pol进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 T7 DNA pol 1976年，Ch

7、ein分离出一种热稳定的聚合酶 1986年，Erlich从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离并纯化了Taq DNA pol，生长在70-75极富含矿物质的环境中 1988年，R.K.Saiki等成功将Taq DNA pol应用于PCR。 水生栖热菌(Thermus aquaticus)yT1株分离提取的Taq DNA pol。 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）提取的Tth DNA pol，活性是Taq DNA pol的100倍 栖热球菌（Thermococcus litoralis）中分离的VENT酶，100时半衰期达95min 酸热浴硫化裂片菌中分离的Sac酶，耐受10

8、0Taq DNA pol的特点 耐高温。在70下反应2h后其残留活性是原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。 在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)Taq DNA pol酶活性 75-80，150bp/s 72，100bp/s 70，60bp/s 55，22bp/s 37，1.5bp/S 22，0.25bp/s TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+ 浓度非常敏感 Mg2+浓度过低，Taq酶活力下降； Mg2+浓度过高，使酶催化非

9、特异性扩增Taq DNA pol的忠实性 Taq DNA pol具有53聚合酶活性和53外切酶活性，而无35外切活性，因而无效正阅读功能，在扩增中可引起错配。 Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4. 降低Mg2+浓度（1.5mmol/L），降低dNTPs浓度（20mol/L），提高退火温度（大于55），缩短延伸时间（60s）可提高Taq DNA pol的忠实性，此时的平均错配率为5 10-6. 低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA pol的催化活性并无影响. 极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷基肌氨酸钠

10、(小于0.02%)， SDS(小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的活性. 非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40和Tritox-100)如5%时方能抑制该酶的活性. 100加热10min以上 加入10 mmol/L EDTA，使其结合Mg2+三、DNA 模板模板的来源 培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本、血液、毛发、尿液、犯罪现场 DNA或RNA，RNA作模板时要反转录成cDNA 线性DNA分子，若为环状DNA，则用酶将其切成线形分子 理论上102-104拷贝的模板可满足各种要求的PCR反应 E.coli DNA0.1ng3104拷贝 人染色体DNA0.1g3104

11、拷贝 酵母DNA1ng 3104拷贝 DNA样品尽量要纯，尤其不能有核酸酶及蛋白酶等 大多PCR，对DNA模板的要求不严格，存在一定量的蛋白质、SDS等对实验影响不大 没有交叉污染四、dNTPs dATP、dTTP、dGTP、dCTP. dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性 dNTP溶液呈酸性，使用时应用1M NaOH将其PH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 PCR常用的dNTP浓度为50200umol/L 4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制) 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 dNTP浓度过低会使反应速度

12、下降，降低PCR产物的产量，但可提高实验的精确性。 dNTP浓度过高，可加快反应速度，但也增加碱基的错配率和实验成本 dNTP与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。五、PCR反应的缓冲液 PCR中常使用10-50mmol/L Tris-HCl（pH8.3-8.8）缓冲液 作用：调节pH值，使Taq DNA pol作用环境维持偏碱性 10-50mmol/L Tris-HCl， 50mmol/L KCl，有利于引物退火，大于此浓度会抑制Taq DNA pol的活性 100g/L BSA（小牛血清），保护酶 0.05-0.1% Tween-20，保护酶 5mmol/L DTT（二硫苏糖醇），保护

13、酶 10% DMSO（二甲基亚砜），减少模板二级结构，提高反应特异性 5%甲酰胺或5%氯化四甲基胺（TMAC），提高反应特异性，对酶活性无明显影响六、Mg2+浓度 PCR反应体系中，dNTPs、引物、DNA 模板等中的磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+浓度 Mg2+浓度要比dNTP的浓度高0.2-2.5mmol/L 在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。七、PCR反应条件的选择变性温度与时间 DNA中GC含量越高，要求的变性温度越高 通常为9530s，或93-94lmin 第一次反应时反应管达到所需温度需要一段时间，因此

14、要适当延长时间。最好为95，7-10min，在以后的循环中，变性步骤设为9530s 为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管中加入液体石蜡退火温度与时间 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。 对于20个bp，G+C含量约50%的引物，55为最适退火温度较为理想。 公式帮助选择合适的温度： Tm=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm(510) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。 复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间 PCR反应的延伸温度一般选择在707

15、5之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合 PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。 延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些延伸终止 最后一个反应循环结束后，应使PCR反应在72进一步延伸5min，以提高产物的扩增率，然后将反应混合液冷却至4，或加入EDTA到10mmol/L终止反应循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。 PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。 一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非

16、特异性产物的量亦随之增多。 八、标准的PCR反应体系 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 2个引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul九、PCR扩增产物的分析 凝胶电泳分析 酶切分析 分子杂交 核酸序列分析第三节 PCR技术的分类正常PCR（Normal PCR） 一般的DNA模板采用一对引物，经30轮左右循环扩增，即可达到预期的目的 常用于多拷贝DNA分子的扩增 PCR产物的检测： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳巢式PCR（Nested PCR） 先用一对

17、引物对模板进行扩增，取出第一次PCR产物，然后再用另一对引物扩增第一次PCR产物 半巢式PCR：只有一个外引物对模板进行扩增，取出第一次PCR产物，然后用另一对内引物扩增PCR产物 中途进退式PCR Drop-in Drop-out PCR 外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，同时在第一次PCR时采用较高的退火温度，而第二次PCR采用较低的退火温度，这样在第一次PCR时，由于较高的退火温度内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物。经过若干循环，待外引物基本消耗完毕后,无须取出第一次PCR产物，只需降低退火温度，即可直接进行第二次PCR扩增.复合PCR Multiplex PCR，多重引物

18、PCR，多重PCR 在同一PCR反应中，用多组引物同时扩增几个基因片段的技术不对称PCR asymmetric PCR 用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA) 。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为501001.反转录PCR reverse transcription PCR，RT-PCR，RNA-PCR 以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成出cDNA第一链；cDNA以自身为模板合成出互补第二链反向PCR reverse PCR 常规PCR只能扩增两端序列已知的目的基因，即两引物之间DNA片段。 反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段锚定PCR Anchored PCR，A-PCR 用酶法在反转录的cDNA3端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点，对该cDNA进行PCR扩增的技术修饰引物PCR Modified primer PCR PCR引物在合成过程中对5端进行修饰，不但不影响扩增反应的进行，而且方便了产物的分析 还可将一些信号分子，如