微生物学设计性实验细菌耐受噬菌体突变率测定演示课件

1、1,细菌耐受噬菌体突变率的测定 微生物创新性试验 第五组：,2,细菌耐受噬菌体的突变是一种自发突变，它的发生与环境因子无关，是随机的非定向突变。,3,本组设计性实验题目： 测定铜绿假单胞菌耐受噬菌体的突变频率,4,实验选材依据和背景,铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa） 原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。,革兰染色,培养,绿脓杆菌,5,研究背景,本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，及术后或某些治疗后的患者易感本菌。 筛选出优

2、良菌种，以便更好地利用其资源进行研究并造福人类。同时又对其外界环境有更大的适应性，更好应用于发展、生产的需要。为获得其菌群，我们采用利用噬菌体将其敏感细菌杀死，从而选择耐受细菌。,6,研究 概述,研究方案：为获得其菌群，我们采用噬菌体将敏感细菌杀死，将发生了耐受突变的细菌选择出来，并繁殖成为优势菌群。,研究意义：培养出优势菌群，为以后临床治疗及临床用药起辅助性作用。,研究目的：测定细菌自然情况下耐受噬菌体的自发突变频率。,研究问题：突变率测定,7,实验材料,1.毒性噬菌体及其相应的敏感宿主菌。 （建议使用人体正常菌群中的细菌及其噬菌体，如大肠埃希菌或铜绿假单胞菌及其相应噬菌体。） 2.LB液体

3、培养基及LB固体培养基。 3.试管、培养皿、刻度定量吸管。 4.酒精灯、接种环、显微镜、普通培养箱等。,8,LB是什么？,LB：Luria-Bertani培养基，即溶菌肉汤。,9,实验步骤,1.准备好铜绿假单胞菌的过夜培养物和相应的噬菌体原液（噬菌体效价1010）,铜绿假单胞菌的倒置过夜培养物,噬菌体原液,10,实验步骤,2.将菌液10倍连续稀释，至少稀释7管，取0.1ml涂布接种LB琼脂平板，37度培养过夜。次日取菌落适宜于菌落计数的平板进行CFU计数，计算出每毫升菌液中的CHU数： CFU数=每个平皿中的CFU数10血清稀释倍数,11,2.,10倍连续稀释，至少7管,12,CFU是什么？,

4、CFU (Colony-Forming Units)：菌落形成单位,菌落形成单位。 将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。与常规利用显微镜对微生物数量进行测量不同，主要是对可见（即多数情况下形成菌落）的细菌数量进行测量的单位。 单位：CFU/mL。指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数，也有用CFU/g即对应固体培养基。,13,通俗的解释,是指每毫升菌液中含有多少单细胞 。传统上就叫“个”。但是，我们知道，一个菌落不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，这时候再叫“个”就不太准确啦，准确的

5、叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。,14,实验步骤,3.进入对数生长后期的大肠埃希菌或铜绿假单胞菌，菌数约为109CFU/ml左右。 23h后，可见菌液逐步变清，待完全变清（月4h之内），将全部菌液均匀涂布到一个LB琼脂平板上，置37下培养过夜。次日计数CFU。,15,4.耐受噬菌体突变频率的计算 第3步中获得的CFU数为1ml菌液中的耐受菌数量，第2步中获得的CFU数为1ml菌液中的总菌数。故： 耐受噬菌体突变频率 =,第3步中获得的CFU数 第2步中获得的CFU数,16,实验可行性分析,1. 标本采集方便 本菌在自然界分布广

6、泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。 采自不同感染部位的标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。,17,2.分离培养容易 本菌生长对营养要求不高。 3. 生长特点明显 该菌在4不生长而在42 可以生长。（可用以鉴别） 4.采用CFU计数的科学性。 5.实验现象明显，便于观察。,18,预期结果,19,预期结果,经相关文献预测： 铜绿假单胞菌耐噬菌体的突变机率在1.410-77.910-7之间。,20,讨论,上述操作3，通常在4h内菌液会完全变清。 此时细菌尚处于生长曲线的“迟缓期”（即适应期），亦即尚未进入分裂状态。如果少数事先存在的耐受菌已进入分裂期，这是测定结果会被放大，因而失其准确性。,21,思考题,(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45左右才能倒平板？ (2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？ (3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。,22,参考文献, 微生物学通报 MICROBI