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文档简介

1、.Q-PCR实验流程一、 总RNA抽提1)细胞培养皿中细胞样品用1X PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)2)加入200l氯仿（5X），剧烈振荡混匀1min，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致)3) 4下，1

2、4000g离心5min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)4)沉淀RNA：加入等体积（1:1）异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀)，室温静置10min;5)4下，14000g离心15min，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4下，14000g离心10min，收集RNA沉淀)，去上清;6)用75%乙醇洗涤两次，12000g离心5min(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡

3、或枪头吸打沉淀)，弃去上清液，空甩一次，以完全去除乙醇，开盖晾35min，反复2次，挥干，使样品变透明。 7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。，打散，备用。二、反转录1) 在RNase free的PCR管中配置下列溶液.Oligd T1 ulRNA4 ulDEPC水3 ul2) 将上述溶液吹打均匀，置70保温5min，使RNA变性。随后4，保持5min， 以防止RNA复性;3) 在该PCR管中加入下列试剂（M-MLV Reverse Transcriptate）E1 uldNTP4 ulMgcl23 ulM-MLV RT 5X buffer4 ul4) 将上述20l反应溶液

4、混匀，空甩，开始反转录：25保温10min;42保温60min;70保温15min;4，。三、调cDNA浓度反转结束后，每个样品加入80 ul的超纯水，混匀，用微量分光光度计检测浓度，先用超纯水校准。20 ul（cDNA）+ 80 ul超纯水100 ul（cDNA）然后将各样品的cDNA浓度调至150 ng/ul.初始浓度 X 100 = 150 X （水 + 100） 加水量 = 初始浓度 X 100/150 100.四、PCR:20 ul 体系酶E10 ul模版2 ul引物2.5 ul水5.5 ul离心甩匀后，放入PCR扩增器中，设置反应体系。五电泳 配胶：1.5% 80 ml 1 X TBE + 1.2 g 琼脂微波3 min，使之澄清，加入8 ul Gelred摇匀（与TBE 1:10000），加入板上，排除

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