第三节动物细胞工程

1、第三节 动物细胞工程【学习目标】1、简述动物细胞培养的过程、条件及其应用2、简述克隆动物的概念含义和基本原理3、简述体细胞核移植技术和动物克隆技术，以及应用前景4、简述动物细胞融合的方法和过程5、简述单克隆抗体的制备过程及其应用【课前预习】一、动物细胞与组织培养1、概念：是指在体外模拟动物体内环境，将动物的 在 的条件下培养，使其继续生长、增殖并维持原有结构和功能的技术。2、条件：动物细胞培养的环境条件，包括 ；动物细胞与组织培养的培养基，可分为 和 。动物细胞与组织培养的细胞，一般为 、 或 。二、细胞核移植与动物体细胞克隆动物体细胞克隆：是将供体体细胞的 与受体 进行人工组合，借助于 的发

2、育能力，经过培养发育成胚胎进而形成个体的技术。细胞核移植技术：是一种利用显微操作技术将某种动物细胞的 移入 或 动物的 内的技术。三、细胞融合和单克隆抗体 1、细胞融合概念：是指在一定的条件下将 细胞融合为 的过程。2、诱导细胞融合的方法有： 法（如 ）、 法（如 ）；和 法（如 ）。3、单克隆抗体制备：给小鼠注射特定的 ，从 中分离B淋巴细胞（即浆细胞）与 细胞融合，经培养，筛选出 细胞，使其在 或 培养，迅速增殖，分泌出 ，即为单克隆抗体。【共同探究】一、动物细胞与组织培养 1、概念：取动物组织块用 酶处理单个细胞形成 转入培养液 培养进行 培养转移到新培养液中2、动物细胞培养的过程：【思

3、考题1】为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？ 细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰

4、蛋白酶作用的适宜环境pH为7.28.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。3、动物组织培养的过程：【思考题2】动物组织培养与动物细胞培养的过程有何不同？【思考题3】幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，

5、则增殖能力越强，所以更容易培养。【思考题4】动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。一般而言，动物细胞培养不需要经过脱分化过程，因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完成个体的能力。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。【小知识】细胞贴壁、细胞的接触抑制将细胞悬浮液置于适宜环境的培养瓶中培养，悬液中分散的细胞很快贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细

6、胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。4、动物细胞培养的条件：对培养液和所有培养用具进行无菌处理。（为什么？）营养（培养基）。根据营养物质的来源，一般将培养基分为 天然培养基 和 合成培养基 ；天然培养基主要取自 、 和 等；合成培养基是人工配制的，包括多种营养物质如 等，合成培养基中仍需加入动物血清，为什么？ 。细胞外培养所需营养与体内基本 （相同、不同）。定期更换培养液，以便 。环境条件：温度。一般与动物的 ，如哺乳动物多为 。 pH。多数细胞生存的适宜pH为 。气体环境。O2是 所必需的；CO2的主要作用是 。O2和CO2的含量不仅影响环境的 ，还直接影响 。【思考题5】为什么

7、对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的血清。5、原代培养与传代培养：原代培养：是指从 培养，一般指10代以内的细胞培养。传代培养：将原代培养的细胞

8、继续培养，这样的培养叫传代培养。一般说来，细胞在传至1050代左右时，增殖就会逐渐缓慢至完全停止，这时有部分细胞的细胞核型可能会发生变化，当继续培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。【思考题6】动物细胞培养与植物组织培养的比较植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞的增殖培养基固体：营养物质、激素等液体：营养物质、动物血清等过程脱分化、再分化原代培养、传代培养结果完整植株动物细胞培养目的快速繁殖，培育无病毒植株等获得细胞的产物或细胞本身，而非动物体。【思考题7】某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对

9、体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。（1）将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于条件适宜且相同的培养瓶中培养。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量 。（2）细胞培养应在含有5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是 。（3）为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的 。（4）已知基因X表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗癌药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A、B两组，A组细胞培养液中加入药物Y，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，培养一段时间后，从A、B两组收集等量细胞，通过分别检测基因X在A、B两组细胞中的 或 合成水

10、平的差异，确定Y的药效。【思考题8】某研究小组对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行动物细胞培养。下列说法正确的是（多选）A在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理B细胞培养应在含5CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺激细胞呼吸C为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素D在相同适宜条件下培养等量的甲、乙细胞，一段时间后，甲细胞数量比乙多二、细胞核移植和动物体细胞克隆技术1、概念：动物体细胞克隆：是将供体体细胞的 与受体去核卵细胞的 进行人工组合，借助于 的发育能力，经过培养发育成胚胎进而形成个体的技术。体细胞克隆的关键是 。【思考题9】为什

11、么不能用单独的动物体细胞发育成新个体，而必须借助于细胞核移植技术？细胞核移植：是一种利用显微操作技术将某种动物细胞的 移入同种或异种动物的去除 内的技术。方法：显微操作技术2、过程：收集动物卵巢，采集卵细胞去除卵细胞的 生出与 基本相同的动物优良品种动物的身体某一部分体细胞（供体）供体细胞培养通过 使两细胞融合将胚胎移入受体母体内激活融合细胞，使其完成 【思考题10】用于核移植的供体细胞一般选用传代10代以内的细胞是为了保证 。用体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？3、意义：克服动物种间杂交障碍、创造新物种；大量复制实验动物；利用异种动物借腹妊娠挽救

12、珍稀动物；利用患者自身的细胞培育新的组织或器官用于组织器官的移植。【思考题11】下图为克隆羊“多利”的培育过程示意图：核移植植入丙羊子宫 发育、分娩适宜条件重组细胞甲羊的乳腺细胞核乙羊的去核卵细胞早期胚胎克隆羊“多利”下列各项有关表述错误的是A克隆羊“多利”的主要性状与甲羊一致，因为其细胞核基因来自甲羊B克隆羊“多利”的培育过程中采用的生物技术有核移植和胚胎移植C乙羊的去核卵细胞为重组细胞基因表达提供了细胞内的环境条件D此过程说明高度分化的动物细胞具有全能性三、细胞融合和单克隆抗体（一）细胞融合1、概念：是指在一定的条件下将 细胞融合为一个细胞的过程。诱导细胞融合的方法有： 法（如 ）、 法（

13、如 ）；和 法（如 ）。【思考题12】杂交细胞是指融合后形成的具有 细胞遗传信息的 细胞。杂交细胞形成过程中，细胞膜的融合依靠 等方法，而细胞核的融合在 时形成。2动物细胞融合的过程动物细胞A动物细胞B诱导融合细胞融合细胞进行 分裂 细胞【思考题13】在动物细胞融合的实际操作过程中是用单个的两种细胞来融合吗？ 。为什么？就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的

14、制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。3、意义：细胞融合技术突破了 方法的局限，使 杂交成为可能。4、应用：动物细胞融合的用途：制备单克隆抗体5、动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞膜的流动性、植物细胞的全能性细胞膜的流动性细胞融合的方法酶解法去除细胞壁后诱导原生质体融合胰蛋

15、白酶处理使细胞分散后诱导细胞融合诱导手段物理法：离心、振荡、电刺激等化学法：聚乙二醇等物理、化学法：同左生物：灭活的病毒主要用途克服远缘杂交不亲和，获得杂种植株制备单克隆抗体的技术之一（二）单克隆抗体制备：抗原小鼠B淋巴细胞培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞多种杂交细胞杂交瘤细胞能分泌特定抗体的杂交瘤细胞体内培养体外培养单克隆抗体【思考题14】过程的目的是 。抗体是由 细胞产生的、可以与 结合并进一步发生变化，形成 ，进而被 吞噬消化。一个B淋巴细胞只分泌 特异性抗体。传统的获得抗体的方法是向动物体内反复注射 ，使动物产生抗体。由于从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差，所以常用 的方法来制备。【

16、思考题15】过程的目的是 ，其方法有 。浆细胞（A）和骨髓瘤细胞（B）经人工方法促融，可能会得到 （以A、B表示）。【思考题16】过程是用特定的 筛选出 细胞。这种细胞的特点是既能 ，又能 。过程是需进行 培养和 检测，以获得 的细胞。 【思考题17】单克隆抗体制备过程中用专一性抗体检测的原理是 。【思考题18】过程是特定的杂交瘤细胞的大规模培养：体内培养是在 中进行，体外的条件有： 。【思考题19】单克隆抗体制备过程中应用了什么动物细胞工程技术： 。2、单克隆抗体的应用作为诊断试剂：由于单克隆抗体纯度高、 ，所以能与抗原发生 。利用 标记的单克隆抗体，在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、

17、心血管畸形等疾病。用于治疗疾病和 ：单抗药物剂型可单独使用，治疗疾病；也可将单抗与 、 、 结合，制成生物导弹，使药物定向发挥作用。【思考题20】下列与应用动物细胞工程技术获取单克隆抗X抗体的具体操作步骤如下，其中对单克隆抗体制备的相关叙述中正确的是 将X抗原注入小鼠体内，获得能产生抗X抗体的B淋巴细胞从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞 利用促细胞融合因子使两种细胞发生融合将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔培养筛选出能产生抗X抗体的杂交瘤细胞 从腹水中提取抗体A实验顺序应当是 B过程中产生的多个杂交瘤细胞也为克隆C过程获得的细胞均可无限增殖 D到的过程中通常要经过两次筛选【反思总结】【课堂巩固】1.（0

18、8全国）下列关于细胞工程的叙述，错误的是A.电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合B.去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体D.某种植物甲乙两品种的体细胞杂交与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同2、(08上海)制备单克隆抗体所采用的细胞工程技术包括细胞培养 细胞融合 胚胎移植 细胞核移植A B C D2,4,63、用a表示骨髓瘤细胞，b表示效应B细胞，则细胞融合过程中两次筛选的目的分别为Aa、aa、ab、bb、ba、aa、abab培养Ba、aa、ab、bb、bab、bb、bab培养Ca、aa、ab、bb、b

19、ab产生特定抗体的ab培养Da、aa、ab、bb、baa能无限增殖的aa培养4、（10四川卷）某实验室做了下图所示的实验研究，下列相关叙述，正确的是A与纤维母细胞相比，过程形成的诱导干细胞的全能性较低B过程是诱导干细胞的结构和遗传物质发生稳定性差异的过程C每个Y细胞只产生一种抗体，故过程不需要选择性培养基进行筛选D过程产生的单抗，不需细胞膜上载体蛋白的协助就能释放到细胞外5、动物细胞体外培养时，通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质。图是血清对正常细胞和癌细胞培养影响的实验结果。从该图提供的信息可以获得的正确结论有A正常细胞与癌细胞的增殖速率相同B有无血清对正常细胞培养的影响不同C培养基中补充

20、血清有助于正常细胞的培养D培养基中是否补充血清对癌细胞的培养影响不大6、下列对植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较，描述正确的是（多选）A动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，诱导融合的方法也完全相同B两者都可以跨越种属间的生殖隔离，突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能C利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为生产单克隆抗体开辟了新途径D目前科学家终于实现了两个植物物种间的体细胞杂交，得到了同时具有两个物种遗传物质的超级植物，并使它们的性状全部得以体现7、（09江苏）动物器官的体外培养技术对于研究器官的生理、病理过程及其机制意义重大。下图是一个新生小鼠的肝脏小块培养装置示意

21、图。请回答下列问题。(1)肝脏切成小薄片，这有利于肝脏细胞 。(2)气室中充入5 C02气体的主要作用是 。(3)培养液中添加抗生素是为了抑制细菌生长，但要注意选择抗生素的 ，以保证抗生素对肝脏无害。(4)有机物X有毒性，可诱发染色体断裂。利用上图所示装置和提供的下列材料用具，探究肝脏小块对有机物X是否具有解毒作用。 材料用具：肝脏小块，外周血淋巴细胞，淋巴细胞培养液，植物凝集素(刺激淋巴细胞分裂)；显微镜，载玻片，盖玻片，玻璃皿，滴管；吉姆萨染液(使染色体着色)，有机物X溶液等。实验过程： 在淋巴细胞培养液中加入植物凝集素培养淋巴细胞，取4等份，备用。 利用甲、乙、丙、丁4组上图所示装置，按下表步骤操作(“”表示已完成的步骤)。 甲 乙 丙 丁步骤一：加人肝脏培养液 步骤二：加入有机物X溶液 步骤三：放置肝脏小块 上表中还需进行的操作是 。 培养一段时间后，取4组装置中的等量培养液，分别添加到4份备用的淋巴