第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学

1、第五讲2 中药及其制剂定量分析的方法学一、提取方法的选择 由于在提取过程中参与因素较多，所以一般以正交设计试验筛选提取条件。 (1)提取方式 (2)浸泡时间 (3)提取时间二、分析方法的选择 用于中药含量的测定方法很多，在选用分析方法时，要根据被测成分的性质、干扰成分的性质等因素进行综合考虑。另外还要考虑方法的灵敏性、准确性和普及性。 中药制剂含量测定大多需用对照品。(1)国家标准收载的含量测定用对照品 (2)国家标准收载的定性鉴别用对照品 (3)自制对照品，需经过结构确认、纯度检查和含量测定等几个步骤。三、测定条件的选择 选择的原则要根据仪器性能和测试方法进行选择 如化学分析中指示剂种类、指

2、示剂用量及终点颜色的选择； 可见分光光度法中显色剂种类、最大吸收波长、显色剂用量、最佳pH值、最佳显色温度、最佳显色时间及线性范围的选择； 紫外分光光度法中最佳pH值、最大吸收波长及吸收系数的测定等； 薄层扫描法中展开剂选择、显色剂选样、检测方式选择、最大吸收波长选择、仪器的线性比参数选择、测定方式、狭缝宽度、扫描宽度、灵敏度等； 气相色谱法中固定相选择、检测器选择、内标物选择、柱效的测定、分离度测定等； 高效液相色谱法中固定相选择、流动相选择、检测器选择、最大吸收波长选择（紫外检测器）、内标物选择、柱效的测定、分离度测定等。四、线性范围试验 线性范围试验的意义 范围试验目的有以下三种。 (1

3、)确定样品浓度或样品量与响应值是否呈线性关系 (2)确定样品浓度或样品量的线性范围 (3)考察标标准曲线是否通过原点，以便确定采用一点法或二点法定量相关系数r五、稳定性试验 六、精密度试验 RSD(七、重复性试验) 八、耐用性试验 九、灵敏度分析方法的灵敏度是指单位浓度（或量）与响应值的比值。 检测限：以信噪比来确定检测限的最低水平。十、空白试验空白试验是消除测定过程中系统误差的一个重要手段。空白试验是在不加试样的情况下，按照试样的分析步骤和条件而进行分析的试验。在中药制剂分析中，因为常常是测量成药中某一味中药中的某一比学成分，要想得到真正的“空白”比较困难。所以常用阴性对照法。十一、回收率

4、1加样回收率 即于已知被测成分含量的成药中再精密加入一定量的被测成分纯品 2以成药空白所做的加样回收率 在成药空白(即除去欲测成分的药材后制成的成药)中加入一定量的被测纯品,依法测定。示例 治伤软膏中苦参碱的含量测定 苦参为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根，具有清热燥湿，杀虫，利尿的功效。苦参中主要含生物碱类成分，有：苦参碱(Matrine)、氧化苦参碱(Oxymatrine)、槐定碱 (Sophoridine)、槐果碱(Sophocarpine)、氧化槐果碱(Oxysophocarpine)等 本研究建立了HPLC法测定治伤软膏中苦参碱的含量，以控制治伤软膏

5、的质量。1试剂和仪器 Shimadzu LC-2010CHT高效液相色谱仪；CLASS-VP V6.14色谱工作站（日本岛津公司） 苦参碱对照品（供含量测定用），批号-；氧化苦参碱，批号-；槐定碱，批号-；氧化苦参碱，批号-，均购自中国药品生物制品检定所； 槐果碱，成都曼思特生物科技有限公司，HPLC纯度 98%；2 色谱条件的选择 2.1 固定相的选择 曾采用苯基柱、C8、ODS、硅胶柱、DIOL和氰基柱，苦参碱、槐定碱和槐果碱均不能达到良好的分离； 考虑到用反相色谱柱时，软膏基质影响色谱柱寿命 最终参考苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱的含量测定方法，选用氨基键合硅胶为固定相,本试验采用Li

6、chrospher NH2(4.6250mm，5m，江苏淮阴汉邦科技有限公司)色谱柱。2.2 流动相的选择 采用氨基柱，试验了如下几种流动相系统，见表1。最终采用苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱含量测定用流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸，结合本药实际情况，将比例调整为 84：9：7。 表1 流动相系统的选择 流动相组成结果乙腈-无水乙醇-3%磷酸(80:10:10)苦参碱出峰太早，有干扰乙腈-无水乙醇-3%磷酸(84:9:7)苦参碱出峰时间合适，无干扰乙腈-无水乙醇-0.1%磷酸(TEA调节 PH至2.5)(80:10:10)苦参碱出峰太慢2.3检测波长的选择 采用苦参国家标准中苦参碱、氧化苦

7、参碱的含量测定用波长220 nm。3 前处理方法的选择 先后采用甲醇水浴提取法，乙醇水浴提取法，氯仿放置过夜提取法，氯仿振摇提取法，氯仿回流法，氯仿超声提取法。 甲醇、乙醇水浴提取方法简单，但提取出的成分复杂，干扰苦参碱的测定。 以氯仿作为提取溶剂提取率高且杂质干扰少，我们比较了以下几种提取方法：氯仿放置过夜提取法、氯仿振摇提取法、氯仿回流法、氯仿超声提取法。氯仿放置过夜提取和氯仿振 摇提取法提取率均不高且操作不便，费时。通过比较，超声提取和回流提取测得的含量接近，因超声提取操作步骤简单，所以选择此方法处理供试品。3.1 超声时间的考察 表2 超声时间的考察 超声时间(min)20304050

8、60苦参碱含量(%)0.056 0.060 0.060 0.065 0.065 3.2冰浴时间的考察 为了防止软膏中脂溶性基质影响色谱柱寿命，采取冰浴的方式使脂溶性基质尽可能析 出，再离心除去。 表3冰浴时间的考察 冰浴时间(min)2040506070测得含量(%)0.0560.0560.0560.0570.057试验结果表明：冰浴1小时以内不会造成样品含量降低考虑时间长有利于基质析出，最终确定为60 min。3.3 复溶溶剂的选择 曾选用甲醇作为复溶溶剂，图谱显示对苦参碱峰有干扰，采用流动相复溶没有干扰，所 以选择流动相为溶剂。4 测定法 色谱条件及系统适用性 以氨基键合硅胶为填充剂；以乙

9、腈-无水乙醇-3%磷酸溶液(84:9:7)为流动相；检测波长220 nm。理论板数按苦参碱峰计算应不低于1500。 对照品溶液的制备 精密称取苦参碱对照品适量，加流动相溶解，制成每1ml含苦参碱80g的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品内容物约2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，尽可能平铺于底部，加氨水1 ml，充分浸润膏体后，精密加入氯仿50 ml，密塞，称定重量，60超声处理（功率250W，频率40kHz）1小时，放冷，再称定重量，用氯仿补足减失的重量，摇匀，转移至分液漏斗中，分取氯仿层，滤过，精密量取续滤液25 ml置100 ml烧杯中，80水浴蒸干，残渣精密加入流动相10 ml，

10、密闭，超声3分钟，并时时振摇，所得溶液转移至10ml具塞玻璃离心管中，密塞，置冰浴中静置1小时，离心20分钟（4000转/分），取上清液作为供试品溶液。 测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20l，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品每支含苦参碱（C15H24N20）不得少于10 mg。5 方法学验证 5.1专属性试验 空白溶剂的制备 流动相作为空白溶剂：乙腈-无水乙醇-3%磷酸（84:9:7）； 苦参碱对照品溶液的制备 取苦参碱对照品约10 mg，精密称定，置50 ml容量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取20 ml置50 ml容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液

11、，精密量取20l，注入液相色谱仪，测定，即得； 苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱混合对照溶液的制备 分别取上述对照品适量，流动相溶解，摇匀，即得； 不含苦参的阴性对照供试品溶液的制备 取不含苦参的阴性对照软膏内容物约2.5 g，依“测定法”中供试品溶液的制备方法操作，即得；软膏供试品溶液的制备5.2定量限 苦参碱对照溶液稀释浓度为每1 ml含245 ng的溶液时，色谱图中苦参碱的信噪比约为10，所以苦参碱的最低定量限为245 ng/ml。5.3线性试验 精密称取苦参碱对照品12.25 mg，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释制成每1 ml含245g的溶液，作为贮备液； 分别精

12、密量取贮备液2、5、10、12.5和20 ml于25 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得稀释液(1)、(2)、(3)、(4)和(5)。 分别精密量取各稀释液20l，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定结果见表。 C（g / ml） 19.6 49 98 122.5 196 245平均峰面积（A） 回归方程 Y=9943.8X-8472.9 5.4 精密度试验 (1)重复性 取批供试品，照“测定法”项下方法操作，一天内共分析6次，计算含量，结果见表。 表5 批治伤软膏重复性试验考察 分析次数123456含量(mg/支)18.118.518.718.417.718.2平均值(mg/支)18.3R

13、SD %1.80(2)中间精密度 依“测定法”项下操作，甲乙两个操作人员在不同时间，用不同的仪器，每次独立测定苦参碱含量，计算中间精密度，结果见表6。 表6 中间精密度试验结果 时间甲人员(mg/支)乙人员(mg/支)第一天(仪器1)18.518.4第二天(仪器1)18.618.9第三天(仪器2)19.019.1平均含量(mg/支)18.8RSD %1.82（3）进样精密度试验表7 进样精密度试验 分析次数123456峰面积平均值RSD %0.185.5 回收率试验 取苦参碱对照品约21 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，用纯水溶解并稀释到刻度，制成422.9g/ml的对照品储备液。 取批供

14、试品的内容物约1.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，制备9份；分别精密加入苦参碱对照品储备液各1、2、3 ml，制成75、100和125三个浓度水平的供试品（每个浓度水平3份），按“测定法”项下测定，由重复性试验知道本批供试品苦参碱含量为0.06，按下式计算回收率： 回收率（测得总量 - 内容物含苦参碱量）/ 对照品加入量（mg）100回收率试验表明，三个浓度水平测定的回收率均在95.0% - 105.0%之间 表8 苦参碱回收率试验软膏内容物称取量(g)对照品加入量(mg)内容物含苦参碱量(mg)测得总量(mg)对照品测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)75%1.26470.4230

15、.7761.1830.40796.395.91.26570.4230.7771.1820.40595.71.26370.4230.7761.1810.40695.9100%1.26450.8460.7761.6060.83098.198.21.26070.8460.7741.6090.83598.71.26780.8460.7781.6060.82897.9125%1.26461.2690.7762.0601.284101.2101.11.26801.2690.7782.0581.280100.81.25101.2690.7682.0531.285101.35.6 溶液稳定性试验 表9 苦参碱含量测定溶液稳定性试验结果 时间(h)0246812峰面积平均值RSD%1.41结果表明：苦参碱供试品品溶液在12小时内稳定。5.7 耐用性试验