双荧光素酶系统实验操作步骤及方法_

1、双荧光素酶报告系统,一、概述,报告基因,reporter gene,是一种编码可被检测的,蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容,易被鉴定的基因,一般的，把报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融,合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，从而利用它,的表达产物来标定目的基因的表达调控,在动物基因表达调控的研究中，报告基因被广泛应用。如,绿色荧光蛋白,GFP,和荧光素酶,荧光素酶,Luciferase,是能够催化不同底物氧化,发光的一类酶的统称，哺乳细胞无内源性荧光素酶,荧光素酶报告基因的优点,蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性,在所有的化学发光反应中，它的光产物具有

2、最高的量子效,率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检,测不到背景发光,检测快速，每个样品只需几秒钟,二、实验原理,利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣,的,基因转录的调控元件,克隆在,萤火虫荧光素酶基因,firefly,构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞,luciferase,的上游,适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶,活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响,刺激物处理,启动子,Luc,未处理对照,启动子,Luc,的转录,测得的荧光值,Luc,表达量,转染细胞,细胞内目的基因,的转录被激活,启动子,Luc,的,启动子被激活

3、,LUC,同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目,和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确,性的影响，将带有海肾荧光素酶基因,Rinilla luciferase,的质粒,phRL-TK,作为对照质粒与报告基因质粒共转,染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验,条件变化的干扰,在测量过程中，当加入荧光素酶检测试剂,II (LARII,时产,生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基,因。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入,Stop & Glo,试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾,荧光素酶反应，同时进行第二次测量,三、操作程序与结果判定,A,检测前相关试

4、剂配制,1. 1X PLB,裂解缓冲液配制：将,4,体积水或,PBS,加入,1,体,积,5X PLB,裂解缓冲液。（使用前在室温平衡,1X,缓冲液,平衡需,2-3 min,2. Luciferase Assay Reagent II (LAR II,配制：将,Luciferase,Assay Buffer II,加入,Luciferase Assay Substrate,充分混合后,分装，置于,20,避光保存。（一次配好，分装成小管,避免反复冻融），使用前将配好的,LAR II,从,20,拿出，并,平衡至室温（需,20-30min,3. Stop & Glo? Reagent,配制：现用现配，

5、先将,Stop ,Glo? Buffer,放在,37,度温箱中平衡至室温,15-30min,，再,将,1,倍体积的,50X Stop & Glo? Substrate,加入,49,倍体积的将,Stop & Glo? Buffer,中,B,样品制备,1,仔细地将生长培养基从待检细胞孔中吸出。用,1XPBS,漂洗,细胞,2-3,次。此过程必须仔细，并尽量将漂洗用,PBS,吸尽,防止细胞掉落,2. 24,孔板每孔加入,100,150l 1X,裂解缓冲液,PLB,以覆盖细胞,然后将,24,孔板置摇床振摇,20-30min,以保证裂解缓冲液完全,裂解细胞,C,双荧光素酶检测,Promega GLOMAX

6、,注：系统运行时请勿触摸操作屏,1,重新设定系统,Tools Settings Reset,2,双荧光素酶检测程序的设定,Protocols Run Promega Protocol DLR-O-INJ OK,3,将,50l LAR II,加入,1.5ml EP,管中（专用的进口,EP,管），取,10l,细胞裂解液加入装有,LAR II,的,1.5ml EP,管中，吹打,2-3,次混匀（尽量不要吹出气泡），置于检测仪，点击,Measure,开始读数（为萤火虫荧光素酶反应强度,使用前,LAR II,要混匀，并平衡到室温,4,测量结束后，取出,EP,管，再加入,50l Stop & Glo? Re

7、agent,吹打,2-3,次混匀（尽量不要吹出气泡），再次置于检测仪,点击,Measure,开始读数（为内参海肾荧光素酶反应强,度）。,Stop & Glo? Reagent,现配现用，不能保存,5,记录读数,每个样品会有,3,个数值,RLU1,萤火虫荧光,素酶反应强度,RLU2,内参海肾荧光素酶反应强度,Ratio,RLU1/ RLU2,一般记录,Ratio,值即可，但,RLU1,和,RLU2,为实际荧光强度值，可以反映细胞的转染效率,也可根据实际荧光强度来调整报告质粒与内参的比例,6,测量完毕后，请将最后检测的,EP,管取出后，关闭仪器,7,实验结果的处理与分析：采用双样本等方差,t,检验进行处,理,P,0.05,为差异显著,P,0.01,为差异极显著,四、注意事项,由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达,到室温后再进行测定,Renilla,荧光素酶检测工作液后需配制后立即使用，不可配,制成工作液后长期保存,Luciferase Assay Reagent II (LAR II,不能反复冻融，保证每,次用同一批次的,LAR II,配好的,LAR II,在,20,度可稳定一,个月，在,70,度,可稳定一年,试剂保存和使用时