hla一dpa13utr单核营酸多态与慢性乙型肝炎病毒感染及肝癌的遗传易感性研究_毕业论文

1、HLA DPA13 UTR单核营酸多态与慢性乙型肝炎病毒感染及肝 癌的遗传易感性研究【立项依据】：人类白细胞抗原(humanleueoeyteantigens，HLA)作为免疫应答的重要基因群，与抗HBV免疫反应及HCC勺发生均有着密切的关系。HBV感染已成为重要的全球性公共卫生问题，预计全球1/3的人口感染过 HBV感染HBV后机体会出现不同的疾病转归，大部分可自愈，其中约5%发展为慢性感染，如慢性乙型肝炎( chronic hepatitis B, CHB ),肝硬化(liver cirrhosis,LC)及原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC )。HBV

2、感染的致病机理较复杂，遗传因素在HBV致病过程中起到了重要的作用，而广泛存在于基因中的基因多态性，即单核苷酸多态性(si ngle nucleotide polymorphism, SNP)可导致机体对各种慢性损伤的反应具有明显的个体差异，影响疾病的易感和不同的疾病转归。HLA复合体是首次发现的与疾病有明确关系的遗传系统。而HLA与疾病的关联主要取决于其丰富的基因多态性。尤其是 HLAII类基因多态性。最新的针对日本和泰国人群中的研究已经证实位于HLA一 D队1基因3 UTR单核营酸多态rs3077刀G与慢性乙型肝炎有关。尽管HBV持续慢性感染机制、与 HCC的关系以及HCC自身发生机制尚未明

3、确，但机体对病原微生物或肿瘤抗 原的免疫反应无疑在疾病进展过程中起关键作用。HLA的主要生物学功能是提呈蛋白质抗原。主要与T细胞免疫有关，由于抗原必须在细胞表面展示，才能被T细胞识别，HLA的作用就是将内源性或外源性抗原以HLA肤复合物的形式，通过 T细胞表面的TCR传递给CD4+和CDS+T细胞，以激活 T细胞产生免疫。同 时，它通过影响 T细胞在胸腺内的发育而塑造个体的细胞库(与免疫耐受有关)，通过影响对抗原肤的选择性结合和提呈而控制适应性免疫应答。HLAI类分子主要参与内源性抗原的提呈，HLAII类分子主要参与外源性抗原的提呈，但也存在交叉提呈现象。而HLA与疾病的关联主要取决于其丰富的

4、基因多态性。HLA基因多态性一方面决定了HLA分子所能递呈抗原肤的基序，另一方面影响T细胞对抗原的识别。 从而造成不同HLA分子结合和提呈抗原肤能力的差异。使得不同的HLA基因对疾病的易感性不同，对同一抗原的免疫应答强度也不同，进而导致疾病转归不同，使其成为可能影响 HBV感染慢性化及HCC发生的主要因素之一，这也是HLA以多态性参与调控对 HBv及HCc免疫应答的重要机制。最近的一篇报道来自 Kamatani和其同事 如实施的一组针对日本和泰国人群的HBV持续HBV感染日本病患感染和基因变异的全基因组关联研究，起始的基因体关联分析比较慢性（共179位）与健康个体（共934位），研究中P值最小

5、的的单一核普酸基因多态性（SNPS）,再进一步与607位独立的HBV感染与1267位对照组个体身上确认，共找出一 1个显著与慢 性HBv感染有关的sNPS（P值=3.62X10 8到1.16xlo ，3）。这11个SNPS都位于或接近 HLA一 DPAI与HLA DPBI基因。重新检验以 1300例患者和2100例对照者为研究对象的 两项日本和一项泰国队列研究中，进一步确认了与慢性HBV感染有关的两个 SNPs HLA 一DPAI 基因 rs3O77A/G 与 HLA DPBI 基因 rs9277535A/G（复合 P 值分别为 6.34x10 一 3， 和2.31x10 一 38，OR=0.

6、57和0.56）。这两个区域的 G等位基因与慢性感染有关，而A等位基因则与保护力有关。研究者推测这些基因可能会导致HLA DP分子抗原提呈效应从而导致HBv持续感染。2010年8月，Hongxing Zhang等报道了一项中国人群的GWA研究结果，位于人类染色体 1p36.22的KIF1B基因的rs17401966位点与HBV相关肝癌有关，该位 点是否在HBV感染不同结局及药物治疗预后中同样存在相关性。2011年7月，一项来自日本的全基因组关联研究（genome-wide association study， GWA）发现，HLA-DQ基因的SNP位点 rs2856718 与 CHB有关；Vi

7、 nod Kumar 等，报道了一项 GWA研 究结果，HLA-DQ 基 因的SNP位点rs9275572与丙型肝炎病毒相关性肝癌有关，该位点是否与HBV感染同样具有相关性，在中国人群中是否存在这种关联，是否与抗病毒药物治疗预后相关，尚未见相关报道。此外，有实验研究发现了与HBV感染结局相关的差异蛋白-真核肽链释放因子 GTP结合亚单位（eRF3b）,它是由GSPT2基因编码，它与 eRF3a （由GSPT1编码，与eRF3b高度 相似，87%勺氨基酸序列相同）共同参与中止真核生物蛋白合成的过程。前期，进行了关于 这两种蛋白与HBV感染的功能学研究，即将探讨GSPT1和 GSPT2基因的两个S

8、N（ rs33635 和rs974285 ）与HBV感染及治疗预后的相关性。实验结果显示：1HLA-DQ多态性位rs2856718与HBV感染及其结局的关系在共显性模型下，携带rs2856718AGrs2856718GG基因型的个体感染 HBV 的风险降低，OR 值分别为 0.738 和 0.4 （ 95%CI=0.571-0.954,P=0.020;95%CI=0.331-0.636, P v 0.001 ）;在显性模型（GG+AG vs AA）和隐性模型（GG vs AA+AQ 下，OR值分别为 0.641 和 0.541 （ 95%CI=0.505-0.814, P v 0.001 ;

9、95%CI=0.403-0.725, P v 0.001 ）;吸烟和饮酒均为 HBV感染的独立危险因素（OR=1.688,P=0.006 ;OR=1.507,P=0.001 ）; rs2856718与HBV自然清除相关， 在共显性模型下，rs2856718与HBV 自然清除有关联，携带rs2856718AG和rs2856718GG基因型的个体 HBV自然清除能力强（AG vs AA, OR=0.642,95%CI=0.479-0.773,P=0.003; GGvs AA, OR=0.528,95%CI=0.361-0.773, P=0.001 ）;在显性模型下，rs2856718GG+AG基因

10、型携带者 HBV自然清除能力更强，发展为 HBV慢性感染的可能性为rs2856718AA基因型携带者的 0.610倍（95%CI=0.463-0.805, P v0.001 );在隐性模型下，rs2856718GG基因型携带者 HBV自然清除能力强，发展为 HBV 慢性感染的可能性为 rs2856718AA+AG 基因型携带者的 0.688(95%CI=0.492-0.962,P=0.029)； 吸烟为 HBV感染的独立危险因素(OR=1.512,95%CI=1.009-2.264,P=0.045 )。2HLA-DQ多态性位点 rs9275572 与 HBV感染及其结局的关系 rs927557

11、2与HBV易感性有关联。在共显性模型下，携带rs9275572AG或rs9275572AA 基因型的个体感染HBV的风险降低，OR值分别为0.706 和0.374(95%CI=0.553-0.903,P=0.006 ; 95%CI=0.244-0.573, Pv 0.001 );在显性模型(AA+AGvsGG 下和隐性模型(AA vs GG+AG 下，OR值分别为 0.627 和 0.429 (95%CI=0.498-0.790, Pv 0.001 ; 95%CI=0.283-0.650, P v 0.001 )，吸烟和饮酒均为HBV感染的独立危险因素(OR=1.635, P=0.002; O

12、R=1.582, P=0.002)。rs9275572 与 HBV的自然清除相关，在共显性模型下，携带rs9275572AG基因型的个体 HBV自然清除率更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs9275572GG基因型携带者的 0.719倍(95%CI=0.544-0.949,P=0.020 );在显性模型下，携带rs9275572AA+AG基因型的个体 HBV自然清除率更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs9275572GG基因型携带者的为 0.714 (95%CI=0.547-0.932, P=0.013);吸烟是HBV自然清除的独立危险因素(OR=1.527,95%CI=1.022-2

13、.282,P=0.039 )。3GSPT多态性位点rs33635和rs974285与HBV感染及其结局的关系本研究尚未发现rs33635和rs974285两个SNP位点与HBV易感性、HBV自然清除及LC进展和HCC进展的相关性。4KIF1B多态性 位点rs17401966与HBV感染及其结局的关系本研究发现rs17401966基因多态性与 HBV自然清除有关联，携带 rs17401966GG基因型的个体 HBV自然清除的可能性更高，发展为 HBV 慢性感染的可能性为rs17401966AA 基因型携带者的0.568 倍(95%CI=0.361-0.894,P=0.015 ); rs17401

14、966基因多态性与 HBV易感性、LC进展及HCC进展无关联。5基因-基因 交互作用经 MDF分析，在HBV易感性研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点(rs2856718、rs9275572 )、GSPT1 位点(rs33635 )和 KIF1B 位点(rs174019664 )之间的交互作用(P=0.0010 )，高危组合易感风险为低危组合的2.643倍(95%CI=1.458-3.487 )。在HBV自然清除研究中，最佳因子模型为 HLA-DQ位点(rs2856718、rs9275572 )、GSPT1位点(rs33635 ) 和KIF1B位点(rs174019664 )之间的交互作用(

15、P=0.023 )，与HBV自然清除的关联强度为 2.024 ( 95%CI=1.156-3.958 )。在LC进展和HCC进展研究中均未发现基因 -基因间的交互作 用。6基因-环境交互作用经 MDF分析，在HBV易感性研究中，准确性和交叉检验一致性最 高的因子模型为 HLA-DQ位点(rs9275572 )、吸烟和饮酒的交互作用(P=0.0010 )，高危组合易感风险为低危组合的3.014倍(95%CI=1.647-4.963 )。在HBV自然清除研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点(rs2856718 )和饮酒的交互作用模型(P=0.0010 ),与HBV自然清 除的关联强度为1.923

16、 (95%CI=1.185-4.032 )。在LC进展研究中，未发现有统计学意义的 基因-环境交互作用模型。在HCC进展研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点(rs2856718 )、GSPT1 位点(rs33635 )、KIF1B 位点(rs17401966 )和吸烟间的交互作用(P=0.0110)，高危组合易感风险为低危组合的1.847倍(95%CI=1.265-3.468 )。研究拟探讨 HLA-DQ(rs28567185 和 rs9275572 )、GSPT( rs33635 和 rs974285 )及 KIF1B( rs17401966 )五个 候选基因与LAM治疗后不同结局的相关性

17、。方法：选择符合条件的研究对象354例，以问卷形式收集研究对象的一般情况，并收集外周血，提取DNA用基质辅助激光解吸电离飞行时 间质谱 (Matrix Assisted LaserDesorption/ionizationTime of FlightMassSpectrometry ，MALDI-TOFMS实验平台进行 DNA的SNPs分型。经LAM治疗6个月后， 根据病毒学应答 (DNA载量v 3log copies/ml或下降 2log copies/ml )与否分为两组(DNA 应答组与DNA非应答组)，根据生化学应答(治疗后ALT在正常参考值范围)分为ALT应答组和ALT非应答组。先进

18、行单因素分析，再用非条件Logistic 回归分析校正混杂因素，分析SNP位点与HBV易感性及其感染结局的关联，并用多因子降维法进行基因-基因和基因-环境之间的交互作用分析，由SPSS16.0统计软件、MDR2.0及MDRPV0.4.6完成数据分析。结果：1HLA-DQ多态性位点rs2856718与DNA应答及 ALT应答的关系rs2856718与DNA应答 无关联，但与 ALT应答具有相关性，rs2856718A等位基因更容易出 ALT应答，在共显性模 型下(GGvs AA), OR值为 2.458 ( 95%CI=1.277-4.730 , P=0.007);在显性模型(GG+AGVs A

19、A)和隐性模型(GG vs AA+AG 下，OR值分别为 1.691 (95%CI=1.093-2.615 , P=0.018 ) 和2.040 (95%CI=1.104-3.772 , P=0.020 );性别是ALT应答的独立影响因素，男性ALT应答率低于女性，年龄、吸烟及饮酒与ALT应答无关联。2HLA-DQ多态性位点rs9275572与DNA应答及 ALT应答的关系rs9275572与DNA应答相关，rs9275572G等位基因更容易出DNA应答，共显性模型(AG vs GG: OR=2.062,95%CI=1.153-3.687, P=0.015; AAvs GG:OR=5.553,

20、95%CI=1.827-16.877,P=0.003 )、在显性模型下(AA+AG vs GG:OR=2.599,95%CI=1.525-4.428, P v 0.001 ) 和隐性模型下 (AAvs GG+AG:OR=4.684,95%CI=1.552-14.133 , P=0.006 )均具有相关性；男性患者拉米夫定治疗后DNA应答的可能性较女性低。rs9275572基因多态性与 ALT应答具有相关性，rs9275572G等位基因更容易出 ALT应答，在共显性模型下(AGvs GG: OR=2.037,95%CI=1.231-3.369,P=0.006;AA vs GG: OR=3.245

21、,95%CI=1.415-7.440,P=0.005)、在显性模型下 (AA+AG vs GG:OR=2.279,95%CI=1.442-3.602,P v 0.001)和隐性模型下(AA vsGG+AG:OR=2.678,95%CI=1.182-6.068,P=0.018 )均存在此关联；性别与ALT 应答相关，男性LAM治疗后的ALT应答的可能性低于女性(OR=0.509,95%CI=0.297-0.872,P=0.014),年龄、吸烟和饮酒与 ALT应答均无相关性。3GSPT1多态性位点rs33635与DNA应答及ALT应 答的关系rs33635C等位基因携带者更易发生DNA应答，在共显

22、性模型下( CCvs TT)，rs33635CC基因型携带者DNA应答的可能性为rs33635TT基因型携带者的2.449倍(95%CI=1.057-5.674,P=0.037)；在隐性模型下(CCvs TT+CT)，rs33635CC 基因型携带者DNA应答的可能性为 rs33635TT+CT 基因型携带者的 2.551 倍(95%CI=1.138-5.716, P=0.023)；性别为DNA应答的独立影响因素，男性 DNA应答的可能性降低。在共显性模型(CC vs TT )和隐性模型下(CC vs TT+TC)，rs33635C等位基因携带者更易发生ALT应答(OR=3.587,95%CI

23、=1.727-7.450,P=0.001; OR=3.84O,95%CI=1.91O-7.72O, PV 0.001 );性别与ALT应答相关，男性患者 ALT应答的可能性均降低。4GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的关系尚未发现GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的相关性。5KIF1B多态性位点rs17401966与DNA应答及 ALT应答的关系 rs17401966与DNA 应答具有相关性，rs17401966G等位基因携带者更易发生DNA应答，在共显性模型下(AGvsAA) , OR值为 3.141 (95%CI=1.826-5.403,

24、 P V 0.001 ),在显性模型下(GG+AG vsAA, OR 值为 3.483 (95%CI=2.045-5.932, Pv 0.001 );在隐性模型下(GGvsAA+AG , OR值为 5.350(95%CI=1.176-24.347, P=0.030);性别、年龄为 DNA应答的独立影响因素，吸烟和饮酒对DNA应答无影响。rs17401966G等位基因携带者更易发生ALT应答，在共显性模型 (AGvsAA)和显性模型 (GG+AG vs AA) 下，rs17401966 与 ALT 应答具有相关性(OR=1.941,95%CI=1.231-3.063, P=0.004; OR=1

25、.687,95%CI=1.089-2.615, P=0.019);性别是ALT应答的独立影响因素，年龄、吸烟及饮酒对ALT应答均无影响。第三部分HLA-DP基因多态性与 HBV感染的Meta分析目的：采用Meta分析的方法，对国内外不同人群的研究结果进行综合评价， 以证实HLA-DP基因的rs3077和rs9277535两个SNP位点是否与 HBV 感染及HBV自然清除有关。方法：以“rs3077 ”为检索词，检索中国生物医学文献数据库、中国学术期刊全文数据库及Pubmed数据库。共检索到 7篇文献，以“ rs9277535 ”为检索词，共检索到8篇文献，经过仔细阅读，共8篇文献纳入meta分

26、析，其中，有两篇文献分别包括4个阶段的研究数据，共获得16个亚组数据，有12个亚组数据用于rs3077位点的meta分析，14个亚组数据用于rs9277535位点的meta分析。提取纳入文献的信息如下： 第一作者、出版年、研究设计类型、受试者来自的国家和种族、病例组和对照组的定义和 数量、提取 DNA和分型的方法。文献未提供等位基因频率的，利用相应的基因型计算，分别提取rs3077和rs9277535位点的相关数据，本研究对 rs3077和rs9277535位点的等位基因、共显性模型、显性模型及隐性模型进行了meta分析。计算优势比(OR及其95%CI作为效应量。首先对纳入分析的原始文献进行Q

27、检验，分析异质性，根据异质性检验结果，选择固定效应模型或随机效应模型求其效应合并值。用漏斗图和Egger s检验进行发表偏倚分析，以P0.05为差异有统计学意义。所有数据用STATA10.0分析。结果： 1HLA-DPA1rs3077与HBV感染及 HBV自然清除的关系经meta分析，结果表明，携带HLA-DPA1rs3077A 等位基因为 HBV感染的保护性因素(OR=O.556, 95%CI=0.527-0.586, P v 0.001 ),携带HLA-DPA1rs3077A等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带 HLA-DPA1rs3077G等位基因个体的 0.556倍；在共显性模型

28、、显性模型及隐性模型中结果相 同(AGvsGG, OR=0.522 ,95%CI=0.485-0.561, P v 0.001; AAvsGG, OR=0.350 ,95%CI=0.311-0.393, P v 0.001 ; GA+AAvsGG,OR=0.478 95%CI=0.446-0.513, P v 0.001 ; AAvsGA+GG, OR=0.48Q 95%CI=0.429-0.536, P v 0.001 )。携带 HLA-DPA1rs3077A 等位基因 的个体感染HBV后自然清除的可能性高，发展成CHB的可能性降低(OR=0.654,95%CI=0.611-0.701, P

29、v 0.001 ),为携带 HLA-DPA1rs3077G等位基因个体的 0.654倍；在共显性模型、 显性模型及隐性模型中结果相同(AGvsGG, OR=0.636, 95%CI=0.577-0.702, P v 0.001 ;AAvsGG,OR=0.446 ,95%CI=0.383-0.520, P v 0.001; GA+AAvsGG, OR=0.595 ,95%CI=0.542-0.652, Pv 0.001 ; AAvsGA+GG,OR=0.565, 95%CI=0.489-0.652, Pv 0.001 )。 2HLA-DPB1rs9277535与HBV感染及 HBV自然清除的关系

30、meta分析结果表明，携带HLA-DPA1rs9277535A等位基因为 HBV感染的保护性因素 (OR=0.582, 95%CI=0.556-0.609, P v 0.001 ),携带 HLA-DPB1rs9277535A等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带HLA-DPB1rs9277535G等位基因个体的 0.556倍；在共显性模型、显性模型及隐性模型中结 果相同(AGvsGG, OR=0.542 , 95%CI=0.506-0.579, P v 0.00 ; AAvsGG, OR=0.371 , 95%CI=0.336-0.409, P v 0.00 ; GA+AAvsGG,OR=

31、0.493 95%CI=0.462-0.525, P v 0.001 ; AAvsGA+GG, OR=0.516 95%CI=0.472-0.564, P v 0.001 )。携带 HLA-DPB1rs9277535A 等位 基因的个体HBV自然清除的可能性高，发展成CHB的可能性降低(OR=0.663 , 95%CI=0.626-0.702, P v 0.001 ),为携带 HLA-DPB1rs9277535G 等位基因个体的 0.663 倍； 在共显性模型、显性模型及隐性模型中结果相同( AGvsGG,OR=0.623 95%CI=0.570-0.681, Pv 0.001 ; AAvsG

32、G, OR=0.464 , 95%CI=0.412-0.523, P v 0.001 ; GA+AAvsGG, OR=0.577, 95%CI=0.531-0.628,P v 0.001 ; AAvsGA+GG,OR=0.430 95%CI=0.390-0.474, P v 0.001 )。第一部分研究显示：1在中国北方汉族人群中，HLA-DQ的两个SNP位点(rs9275572和rs2856718 ）与HBV的易感性，HBV自然清除及HBV感染后的相关疾病进展有关。rs9275572A 和rs2856718G为HBV感染的保护性因素， 在HBV自然清除、LC进展和HCC的进展中起到保 护作用

33、。2KIF1B rs17401966 基因多态性与 HBV自然清除有关联，携带 rs17401966GG基因 型的个体HBV自然清除的可能性更高，与HBV易感性、LC进展及HCC进展无关联。3本研究未发现 GAPT1rs33635和GAPT2rs974285两个SNP位点与 HBV易感性、HBV自然清除及 LC 和HCC进展的相关性。4吸烟和饮酒均为 HBV感染、HBV自然清除的独立危险因素；年龄越 大，越容易由CHB进展到LC和HCC男性、高龄及饮酒为 HCCS展的独立危险因素；在HBV易感性、HBV自然清除及HBV感染不同结局中， 存在基因-基因和基因-环境的交互作用。 第 二部分研究发现

34、：1HLA-DQ多态性位点rs2856718与DNA应答无关联，与ALT应答具有相关 性，rs2856718G等位基因可能为 ALT应答的保护性碱基。性别是DNA应答和ALT应答的独立影响因素，女性更容易出现DNA应答和ALT应答。2HLA-DQ多态性位点rs9275572与DNA应答及ALT应答有关，rs9275572A等位基因携带者 DNA应答和ALT应答的可能性增高，性 别和年龄为DNA应答的独立影响因素，性别为ALT应答的独立影响因素。3GSPT1rs33635C等位基因是DNA应答和ALT应答的保护性因素，女性DNA应答和ALT应答的可能性更高。4尚未发现 GSPT2多态性位点rs9

35、74285与DNA应答及 ALT应答的关联。5KIF1B rs17401966G 等位基因为DNA应答和ALT应答的保护性碱基，性别和年龄为DNA应答的独立影响因素，性别为ALT应答的独立影响因素。6经MDR分析，LAM治疗后的DNA应答和ALT应答不仅受到遗传因素的影响，同时又受到环境因素的影响，并存在基因-基因和基因-环境之间的复杂的交互作用。后面研究发现：1通过meta分析证实，携带 HLA-DPA1rs3077A等位基因是HBV感染的保护性因素，携带此等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带rs3077G个体的0.556倍；而且还证明 HLA-DPA1rs3077A等位基因为HBV自

36、然清除的保护性因素，携带 该等位基因的个体 HBV自然清除的可能性更高。2通过meta分析证实，HLA-DPA1rs9277535A 等位基因也是HBV感染和HBV自然清除的保护性因素，携带该等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带HLA-DPB1rs9277535G等位基因个体的 0.556倍；携带HLA-DPB1rs9277535A 等位基因的个体 HBV自然清除的可能性更高，发展成CHB的可能性降低。目前由于关于HLAII类基因单核甘酸多态性与 HCC易感性的报道仍然比较缺乏。但由于HBV持续感染和HCC有着明确的相关性，可以推测与HBV感染有关的多个 SNP可能与HCC 的发生也有相

37、关性；另外，HC旦在机体内发生发展，机体的免疫系统可能通过多种途径 参与抗肿瘤的免疫效应，以消除肿瘤细胞或控制肿瘤的生长，这其中也包括HLAII类分子所参与的对HCC细胞相关抗原的加工、处理和提呈及其他抗肿瘤机制，因此推测HLAII类 基因的单核甘酸多态性同样对 HCQ的发生、发展以及转移有着至关重要的作用。参考文献1. Ga nemDPri neeAM:HePatitisBvirusi nfeetio naturalhistorya ndeli nicale on seque nees.NEn glJMed2004;350:1118 一 1129.2. LuFM, ZhuangH:Manag

38、ementofhePatitisBinChina.ChinMedJ(Engl)2009;122:33. LinTM， ChenCJ， WUMM YangCS, ChenJS， LinCC， KwangTY, HsuST， LinS 丫HsuLC:HePatitisBvirusmarkersinChinesetwins.AntieaneerRes1989;9:737一 741.4. CullenM , MalaskyM, HardingA , CarringtonM:High一 densitymaPofshorttandemrePeatsacrossthehuma nm ajorhistocom

39、patibilitycomplex .Immunogen eties2003:54:900910.5. HughesAL:Evolut i onofi ntronsande xon sofelass11majorhistocomPatibilitycomplexgen esofvertebrates .Immunogen eties2000:51:473 86.6. JungMC, PapeGR:llnmunologyofhePatitisBinfeetion.LaneetInfeetDis20O2;2:43一 50.7. AnisfeldA M, Kastwoelber H R, Meyer

40、m E, et al. Syndecan-1 expression is regulatedin an isoform-specific manner by the farnesoid-X receptorJ. J Biol Chem, 2003, 278 (22): 20420-20428.8. Wata nabem, Houtern Sm, Wang L, et al. Bile acids lower triglyceride levels viaa path-way in volvi ngFXR, SHP, and SREBP-1cJ. J ClinIn vest2004,113(10

41、):1408-1418.9.AudreySirve nt,ThierryClaudel, Genevieve Martin,etal.The farnesoidX receptorin ducesvery low den sitylipoprote in receptor geneexpressi onJ。FEBSLetters,2004, 566 :173-177.10.Stayrook KR,Bramlett KS,Savkur RS,et al.Regulation of carbohydrate metabolismby the farnesoid X receptorJ.E ndoc

42、ri nology,2005,146(3):984-991.11.Urizar NL,Dowhan DH,Moore DD,et al.The farnesoidX-activated receptor mediatesbile acid activati on of phospholipid tran sfer prote in gene expressi on J.JBiol Chem, 2000,275(50):39313-39317.【研究方案】：l.【研究目标】：通过大样本量的病例一对照，以SNP为遗传标记，研究HLA DPAI基因rS3O77A/G 与慢性HBV感染及HCC的发病风

43、险的关系。2 .【研究内容】：1) .在中国人群中对rs3077刀G与慢性乙型肝炎的遗传易感性进行验证；2) .研究该多态与慢性 HBV感染不同结局的关系；3) .对该基因多态与HCC的遗传易感性进行分析；4) .探讨该基因多态可能的作用机制。3 .【研究方法】：一、应用聚合酶连反应 (polymerase chain reaction,PCR)和限制性片段长度多态性(restrition fragmeng length polymorphism,RFLP )检测了 417 例慢性乙型肝炎患者、 402 例无症状慢性 HBV携带者、453例肝癌患者以及表面抗原阴性的 729例正常人群的rs3O

44、77 多态，比较不同基因型与上述疾病风险的关系。4 .【技术路线】：1 .将所有研究对象分为四组：正常对照组，慢性乙型肝炎组，无症状慢性HIV携带者组，肝癌组。每个研究对象均捐献外周静脉血2ml以获取基因组 DNA用于基因型分析。2 .基因组DNA的提取(酚一氯仿抽提法):基因组DNA用蛋白酶K和饱和酚一氯仿常规方法提取。将收集的抗凝血标本从20oc 取出，置室温融化后转入另一洁净离心管，于5000xg离心巧min:弃上清，在下层血细胞中加入适量 DNA裂解缓冲液(含10mMpH8.0Tris HCI , 0.IMEDTA , 20拼目mL胰RNA 酶，0.5%SDS)，充分混匀后置 37C水

45、浴lh，加入蛋白酶 K(终浓度为100协留mL)，混匀 后于37C水浴过夜；加入等体积Tris 一 HCI平衡的饱和酚 (pH7.4)，充分混匀后于8000xg离心巧min;转移上层水相至另一洁净离心管，加入等体积饱和酚：氯仿(1:1)，混匀后8000xg离心巧min;转移上层水相至另一洁净离心管中，加入10%体积的乙酸钱溶液(10M)和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后置一20oCZh;捞出沉淀的DNA并用75%乙醇洗涤两次，溶于适量 Tris 一 EDTA(TE)缓冲液(含10mMTris 一 HCI , 1mMED 认， pH8.0):用紫外分光光度计测定DNA纯度及浓度。3 . HLA 一

46、 DPAI基因型分析以蛋白酶K和饱和酚一氯仿常规方法提取基因组DNA。HLA-DPAI基因的单核普酸 多态的基因型均以 PCR扩增产物的限制性片断长度多态性 (PCR RFLP)方法确定，具体 描述如下：(1) PCR引物：扩增HLA-DPAI基因的3 -UTR 区含T/C多态的引物为 rs3077F 5 -GGA CTT AGG AGA GAT CTG AAC TCC A 一 3和 rs3O77RS 一 TCA GCA ATT CAG TCA GCC ACT CG 一 3,产物为102bp，其中rs3o77R引物的3端的倒数第二个 C为错配碱 基。(2) PCR 条件:25ul 反应体系中含

47、 100ng 模板 DNA , 0.1uM 各引物，0.2mMdATp、dGTp、 dCTp和dTTp混合液，1UTaqDNA聚合酶及其lGel反应缓冲液。热循环条件为 ：95摄氏 度预变性2min，然后94摄氏度30sec 60摄氏度30Sec, 72摄氏度30Sec, 39个循环后 72摄氏度延伸10min。(3) 基因型分析：限制性核酸内切酶 XhoI(New England Biolabs , Ipswich , MA)用于T_C多态的基因型分析。酶切在 10ul反应体系中进行，其中含8ulPCR产物、1乘以反应缓冲液 和6U相应核酸内切酶。将反应混合液置37摄氏度水浴10h,限制性酶

48、切产物在 3.5%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶图像分析系统GDS 一 8000(UVP , USA)分析电泳图谱，判断各基因型。T等位基因含一个双 oI酶切位点，而 C等位基因不含 XhoI酶切位点，因此CC基 因型只有一个 102bp片段，而TT基因型有78bp和24bp的两个片段，TC杂合子基因型 有IOZbp、78bv和24bp的三个片段。为保证基因分型的可靠性，基因分型实验在不知道标本是病人还是对照的情况下进行。此外，我们随机挑选 15%标本，由另一实验者进行重复检测，结果与第一次分析结果完全 一致。同时，作为二等位多态，本研究中尽管针对T/C进行基因分型，由于文献中多以其互补链上的A/G

49、对其多态进行描述，我们采取同样的方法。统计分析：组间频率的单因素分析如年龄、性别以及等位基因频率等以x2才检验比较。以非条件Logistic回归模型，对年龄和性别进行校正后，计算比值比(odds ratios, ORs)及其95%可信区间(Cls)及基因型差异的P值。所有统计检验均为双侧概率检验，以PV0.05为统计学显著性差异标准。所用统计软件为StasticAnalysis systems 12版)。同时计算正常对照组的基因型频率是否符合 Hardy W einberg平衡定律。5. 【预期成果】：rs3077多态位点的基因型在病例组和对照组间的分布符合Hardy 一 Weinberg平衡

50、定律。rs3O77 A等位基因显著降低了慢性乙型肝炎的发病风险，且呈等位基因一剂量效应。进一步分析显示，该等位基因同样降低了无症状HBV携带者、HBsAg阳性的肝癌及总体肝癌的发病风险，且同样呈等位基因一剂量效应。然而，该等位基因与HBsAg阴性的肝癌发病风险不相关，也与无症状HBV携带者进展为肝癌的风险无明显相关性，却反而促进了慢性乙型肝炎进展为肝癌的发病风险。6. 【研究计划】：1）订购实验材料及试剂如：Tris碱,SDS，胰RNA酶，Taq DNA聚合酶,dNTP，Xhol，琼脂糖；准备相关实验仪器。2）选择合适的研究对象，包括正常对照者、慢性乙型肝炎患者、无症状慢性HIV携带者、肝癌患者，收集血标本保存待用于检测。3 ）基因组DNA的提取（酚一氯仿抽提法），及进行HLA DPAI基因型分析。4 ）进行统计学分析。7. 【实验条件与基础】：实验条件：主要试剂有：Tris碱,SDS，胰RNA酶，Taq DNA聚合酶，dNTP，Xhol，琼脂糖