Clontech_抑制性削减杂交PCR中文说明书

1、抑制性削减杂交 PCR削减杂交是一强有力的使研究人员能够比较两种mRN群和获得仅在一 mRN群表达而在另-mRN鮮没有表达克隆的强有力的技术。虽然有几种不同的方法，但削减杂交背后的基本理论却非 常简单。首先，两组 mRNA转化为cDNA我们将含有特异(差异表达的)转录物称为“ tester ” 对照cDNA称为“ driver ”。Tester和Driver cDNA进行杂交，接着去除杂交序列。结果，保留的 未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达，而在driver组不表达的mRNA虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用，但要求几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息。CLONTECH

2、CR-Select cDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。图1表示 PCR-Select 过程的简短回顾。本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。方法仅要求0.5-2 g polyA0+ RNA，花34天时间，也不用分离ss和ds分子。而且，抑制性 PCR预防了不 需要的扩增而使目标分子得到富集。图2详细地描述了发生在PCR-Select cDNA消减杂交分子事件。首先，cDNA从 0.5-2 g的 polyA+ RNA合成。Tester和driver cDNA 以Rsal酶切，该酶为一四碱基限制性内切酶，产生平 末端。 Tester cDNA 接着分成两部分，每一部分连一

3、不同的 cDNA adaptor。 Adaptor 的末端无磷 酸基团，因此仅有 adaptor 的一链与 cDNA 5末端相连。两 adaptor 具有不同的序列，这样当残 留末端被补平后就能够同两个不同的 PCR引物退火(Appendix B)。接着进行两轮杂交。首先，过量的 driver cDNA 加入到每一 tester 样品，然后热变性和退 火，在每一样品产生 a、b、c 和 d 分子( 图 2) 。由于杂交二级动力学的原因，高丰度分子退火快， 因此高和低丰度序列在 a 型分子中的浓度趋于均衡。同时，与在 driver 中没有差异表达的分子 c 型 ss 分子明显富集。在第二次杂交期

4、间，两第一次杂交的样品不经变性直接混合。现在，仅有保持平衡的和消减 的ss tester cDNA 能够重新配对形成新的e型杂交体。这些新杂交体成为具有不同的ds DNA分子，分别为tester1(与adaptor1相连)和tester2(分别与adaptor2相连)。将新变性的driver cDNA 加入无需再次变性的已经第一次杂交反应的两混合物，进一步富集差异表达序列e型分子。经DNA多聚酶补平末端后， e 型分子差异表达的 tester 序列在 5和 3端具有不同的退火位点。接着整个分子群进行PCR以扩增需要的差异表达序列。在 PCR中, a和d分子无引物退火位 点，因而不能被扩增。由于

5、抑制性 PCR效应，绝大多数b型分子形成盘状结构而阻止其指数扩增 (Appendix A) 。 c 型分子仅有一个引物结合位点而仅能被线性扩增。仅有 e 型分子，有两个不同 adaptor ，能被指数扩增，产生均衡的差异表达序列。进而，进行第二次PCRT增以进一步减少背景和富集差异表达序列。此时，差异表达的cDNA就能直接插入 T/A 克隆载体(例，使用 CLONTECHs AdvanTAge PCR Cloning Kit, #k1901-1)或任何使用RsaI位点作为adaptor/cDNA连接的载体。然后，差异表达的 RNA能被测序、杂交分析鉴 定。PCR混合物也可用作杂交探针进行 DN

6、A文库筛选。PCR-Select differential screening获得消减cDNA文库后，重要的是确认代表差异表达基因的的单个克隆，This is typicallyaccomplished by probing Northern blots with randomly selected, subtracted clones。然而这既耗时又低效，尤其是关系很近的 RNA populations 相互比较消减文库中可能包含相当数量的假 阳性。在 Northern 杂交分析前利用消减文库的差异筛选有助于减少假阳性，节省时间和精力。如果你的起始材料有限，你可以用 CapFinder PC

7、R cDNA Synthesis Kit (#k1052-1) 预先扩 增你的总RNA以用于PCR-Select Kit.当总RNA用常规方法合成cDNA寸，即便是使用Oligo(dT) 引物，核糖体RNA也会同polyA+ RNA一起被反转录。如果这种 cDNA用于PCR-Select Kit，过量的核糖体RNA和低浓度的与PolyA+ RNA相对应的cDNA浓度将导致无效减法杂交。使用 CapFinderPCR cDNA Synthesis Kit 可直接用于 PCR-SelectcDNA合成tester和driver ds cDNA 从待比较的 mRNA合成Rsa I消化Tester 和

8、 driver cDNA 分别消化以获得短的平末端分子Adaptor 连接试验组平分成两份，分别连上不同的 adaptor, 但 driver cDNA 无 adaptor第一次杂交杂交动力学导致均衡和富集差异表达序列第二次杂交以产生用于PCFT增模板的差异表达序列第一次PCRT增使用抑制性PCR仅差异表达的序列呈指数级扩增第二次PCR扩增背景减少，不同表达的序列进一步富集图1. CLONTECH PCR-Select过程的概况，含特异转录物 cDNA称 tester，对照称driver消减杂交，即便是总RNA用作起始材料(注意：使用CapFinder PCRcDNALibrary Const

9、ruction Kit AK1051-1产生的擦与PCR-Select Kit并不相容。)一旦你确定了差异表达 cDNA那么Marathon&trade cDNA Amplification Kit (#K1802-1) Marathon Ready&trade cDNA 可以提供优秀的克隆相应全长的 方法(Che nchik et al. 1996)。欲求更多的信息，参阅相关产物的描述。二、试剂成分表RNA存于-70 C,储存4杂交液于室温。其它储存于-20 C。本试剂盒提供的足够7次cDNA合成的 试剂。每次反应最好使用2 g polyA RNA但也可少至0.5 g。但是，如果使用低于2

10、g的polyA RNA 在消减过程中，低丰度的差异cDNA可能丢失。7次cDNA合成相当于6次完全的消减实验和1次对照。 如果每次合成用于不同实验的tester和driver(在特殊系统鉴定上调或下调 cDNA，PCR式剂足够50 次primary和100次secondary PCR反应。参阅附录 B的primer和adaptor序列。第一链的合成7 l AMV 反转录酶( 20unites/ l )200 l 5 第一链缓冲液250mM Tris-HCl (pH8.3)40mM MgCl 2150mM KCL5mM Dithiothreitol(DTT 二硫苏糖醇 )第二链合成*28 l 2

11、0 第二链酶混合物1.2u/ l )(DNA多聚酶 1, 6u/ul , RNase H, 0.25u/ l, E.coli DNA 连接酶,*200l 5第二链缓冲液500mMKCl50mMAmmonium Sulfate(硫酸氨)25mMMgCl20.75mM-NAD100mMTris-HCl (pH7.5)0.25mg/mlBSA 牛血清白蛋白*14lT4 DNA多聚酶(3u/ l )内切酶消化*200l 10Rsa1 限制缓冲液100mM Bis Tris Propane-HCl (pH7.0)100mM MgCl21mM DTT*12 l Rsa1 (10u/l)Adaptor 连接

12、*21 l T 4DNA连接酶(400u/ l;含 3mM ATP* 30 l Adaptor1 (10 M)* 30 l Adaptor2 (10 M)*200 l 5DNA连接缓冲液250mM Tris-HCl (pH7.8)50mM MgCl210mM DTT0.25mg/ml BSA杂交*200 l4杂交缓冲液*1.4ml稀释缓冲液 （pH8.3）20mM HEPES-HCl (PH 6.6)20mM NaCl0.2mM EDTA (pH8.0)PCR扩增*50l PCR 引物 1 (10 M)*100l巢氏PCF引物1(10 IM)*100l巢氏PCF引物2R (10 M)*10l质

13、控消减 cDNA对照实验*5 l 对照 polyA RNA （1ug/ul, 来源于人骨骼肌 ）*10 l对照 DNA（3 lg/ l ）（Hae川-消化的细菌噬菌体x174 DNA）*50lG3PDH 5 引物（ 10 M）*50lG3PDH 3 引物 （10 M）这些引物可以扩增人、大鼠、小鼠 G3PDH 般试剂*20l dNTP* 混合物10mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP*100l 20 EDTA/glycogen mix(0.2M EDTA; 1mg/ml glycogen)*400l NH4OAc (4M)*1ml 灭菌水三、另外所需试剂下面的试剂是需要

14、的，但未提供*Hae3消化的噬菌体 X174 (#6310-1 , 2):凝胶上 DNA Marker用*0.5mlPCR 反应管，推荐 Perkin-Elmer GeneAmp*80%和 96%乙醇*酚：氯仿：异戊醇( 25： 24： 1)。按下配制：1 、重蒸酚2、等体积灭菌 TNE缓冲液平衡(50mM Tris,Ph7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA)3、室温下 2-3 小时4、去除上层水相5、加入等体积氯仿：异戊醇(24： 1) ，完全混合，去除上层相6、储存下层酚：氯仿：异戊醇于4C,最多2周*氯仿：异戊醇 (24： 1)*50 PCR酶混合物推荐 ClonTECH

15、Advantage TM KlenTaq Polymerase Mix(#8417-1)*10 PCR缓冲液*dNTP 混合物(10mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP*TAE 电泳缓冲液配制 50 储存液：242g Tris57.1ml Hac加水至 1 升四、Clontech PCR-Select cDNA 消减步骤A、一般事项*戴手套以防RNA和cDNA羊品被核酸酶降解*本手册的循环参数已使用 Perkin-Elmer DNAThermal Cycle 480 和 Perkin-Elmer GeneAmp Systems 2400/9600 优化。不同的循环仪可能需要不同的

16、循环次数、 50 polymerase 混合物和模板*必须使用热启动以减少非特异 DNA合成。我们推荐TaqStart Antibody或人工热启动。本步骤已用TaqStart 抗体调号（包含在 Clontechs Advantage KlenTaq Polymerase Mix 中）*悬浮沉淀和混合反应时，轻轻上下吹打，短暂离心以将成分沉于管底。*用旋涡振荡酚：氯仿抽提混合物*向混合物中最后加酶，轻轻上下吹打以将酶和混合物混匀*不要增加酶量和反应的DNA浓度。量和浓度已优化好了。*虽然不是要求的，推荐使用-32PdCTP进行第一链合成以定量产生的 cDNA确定DNA沉淀的效 率，以利解决合成

17、cDNA的困难。C、cDNA第一链的合成使用tester、driver和对照polyA RNA完成本操作。本节得到的cDNA将作为以后步骤的对照 cDNA在下节，将通过加入少量质控cDNA（Hae3消化的X174）到骨骼肌dsDNA以制作模拟tester cDNA 用这些骨骼肌 tester 和 driver cDNA 与自己的消减实验平行作一完整的对照消减实验。对照消减实 验可用于估计合成的cDNA的产量和大小范围。它也是证明实验的多步骤是否有效的最好办法。1、对每一实验，tester,driver和对照骨骼肌polyA RNA在一消毒的0.5ml离心管中混合下列成分（不要用聚苯乙烯管 ）：

18、polyA RNA （2 g）2-4 l*cDNA合成引物（10 M） 1 l*对于对照合成，加入 2 l 骨骼肌 polyA RNA如果需要，加入 2 l 消毒水至终体积 5 l ，混匀成分，短暂离心。2、在PCR仪中，70 T温育2分钟3、冰上冷却 2 分钟 4 、 短暂离心5 第一链缓冲液dNTP Mix(10mM each)1l消毒水 * 1 lMML反转录酶(200u/ I) 1l- 32PdCTP( 1 0mCi/ml, 3000Ci/mmol) 以 9 l 水稀释，代替*为了监测cDNA合成的进展，将1 l 上面的水加入以标记6、轻轻振荡，短暂离心7、42 C,空气孵箱中1.5h

19、注：不要用水浴或PCR仪。蒸发可能减少反应混合物体积，减低反应效率8、反应管置冰上以终止第一链合成并立即进入D节D、cDNA第二链合成使用每一第一链 tester 、 driver 和对照骨骼肌 cDNA1、在第一链合成管中 （含 10 l） 加入预先冰上冷却的下列成分：消毒水48.45 第二链合成缓冲液16.0dNTP Mix(10mM)1.620 第二链酶混合物4.02、混匀并短暂离心，终体积应为 80 l3、16 C （水浴或PCF仪）孵育2小时4、加入2 l （6u） T4 DNA多聚酶，混匀5、16 C孵育30分钟（水浴或PCF仪）6、加入 4 l 20 EDTA/glycogen

20、混合物以终止第二链合成7、加入 100 l 酚、氯仿、异戊醇混合物（25:24:1）8、混匀， 14000rpm 10min, RT9、取上清于另一清洁 0.5ml 离心管10、加入 100 l 氯仿、异戊醇混合物 （24： 1）13、混匀， 14000rpm 20min, RT 14 、 去上清15、如果使用-32PdCTP,用Geiger计数器检测沉淀放射性16、沉淀中加入500 180%乙醇17、14000rpm 10min 去上清18、如果使用-32PdCTP,用Geiger计数器检测沉淀放射性19 、 空气中晾 10 分钟以蒸发残留乙醇20、50 I dH 2O溶解沉淀电泳21、 取

21、6 l加入另一新干净离心管。储存样品于-20 C直到Rsa1消化物琼脂糖凝胶以估计产量和合成的cDNA大小（见V.A节）E、Rsa1 消化用每一实验 ds tester 和 driver cDNA ， 段以供消减杂交和F节与adaptor连接。对照骨骼肌cDNA这一步产生短的、平末端dscDNA 片1、 在一试管中加入：ds cDNA43.510 Rsa1 缓冲液5.0Rsa1 (10u/ l)1.52、旋振混匀并短暂离心 3、37C孵育1.5小时4、用5 l消化物分析Rsa1消化效率（参阅Section V.B）5、加 2.5 l 20 EDTA/glycogen 以终止反应6、加入 50

22、l 酚、氯仿、异戊醇混合物 （25：24：1） 7 、混匀8、14000rpm 10min 9 、取上清置于一清洁 0.5ml 离心管10、 加 50 l 氯仿、异戊醇 （24：1）,混匀11、14000rpm 10min12、上清移入一 0.5ml 清洁离心管13、力卩 0.5vol 4M NH OAc和 2.5vol 95% 乙醇16、去上清17、80%乙醇 200 l 洗沉淀18、14000rpm, 5min19、 去上清，若使用-32PdCTP,用Geiger计数器测沉淀放射性20、空气干燥沉淀 5-10min21、5.5 I dH 20溶解沉淀，-20 C保存准备实验driver c

23、DNA和对照骨骼肌driver cDNA到此完成。按SectionF完成实验和对照 骨骼肌 tester cDNAsF、Adaptor 连接准备 adaptor 连接的 tester cDNA 的实验计划如图 3所示。对于每一个实验组 tester cDNA 和 对照骨骼肌 cDNA需要制备一与 Adaptor-1 相连的tester(Tester1-1) 和一与Adaptor-2 相连的 tester(Tester1-2), 和一连接了双 adaptors 的 tester cDNA( 非杂交的 tester controI 1-c) 。非杂 交的tester对照用作消减杂交的阴性对照。Ad

24、aptors提供了不同的PCR引物退火位点。下面的步骤用于完成每个不同的实验 cDNA和对照骨骼肌tester cDNA 。 Adaptor不能连于driver cDNA 。1、对于每一实验tester cDNA用5 l消毒dHO稀释1ul来源于Section E的Rsa1消化的实 验 cDNA。2、准备对照骨骼肌 tester cDNAa. 用无菌H2O稀释Hae3-消化的 X174 DNA至终浓度150ng/ml.b. 用 5 l 稀释的 X174/Hae3 DNA混合 1 l 骨骼肌 tester cDNA(150ng/ml)这就是对照骨骼肌tester cDNA,含0.2% Hae3-

25、消化的 X174 DNA每一片段相当于总cDNA 的0.02%。当用骨骼肌tester cDNA和driver cDNA消减杂交后，在最后的PCR产生的主要条带 应对应于这些对照片段。3、准备用于所有连接和一个额外反应的足够 Master Mix ，在一个 0.5ml 的离心管里混合 3 l 消毒dfO, 2 l 5 连接缓冲液和1.0 l T 4 DNA连接酶(400u/ I)。注意：连接所需的ATP在T4 DNA连接酶里(初始为3Mm结束时为300 M)4、对于每一实验 tester cDNA 和对照骨骼肌 tester cDNA ，按下表顺在一 0.5ml 离心管中混合下 列试剂，上下吹

26、打以完全混匀。表 1 、配制连接反应( 重复实验 tester cDNA和对照骨骼肌 cDNA）管号成分12Tester1-1(l) Tester1-2(l)稀释的实验tester cDNA22Adaptor1(10M)2-Adaptor2(10M)-2Master Mix66终体积10105、在一新的离心管中， 混合 2 lTester1-1 和 Tester1-2，这就是非消减的 tester control1-c 。连接后，该官的1/3的cDNA分子会在其禾端带上两个不同的adaptors6、短暂离心，16C过夜7、加入 1 l EDTA/glycogen 混合物终止连接反应8、72 C

27、, 5min以灭活连接酶9、短暂离心。制备实验和对照骨骼肌Adaptor 连接的Tester cDNA 1-1 和1-2 就完成了。10、从每一非消减 tester control(1-c， 2-c ， 3-c) 取 1l稀释于1ml H2O,该标本将用于 PCR扩增(Step IV 1.1)11、标本储存于 -20C完成连接效率分析 （方法在 SectionV.C） ，然后作 Section IV.GG、第一次杂交重要启示：在进行下面描述的杂交之前，我们推荐完成连接效率分析 （Section V.C, 结果分析和 困难指导 ） 。如果连接没有成功，在杂交之前应重复连接反应。在下面的过程中，每

28、一 tester cDNA均加入过量的cDNA然后标本热变性和退火。退火之后， 高丰度和低丰度序列的 ss 形式被均衡，因为由于二级杂交动力学的原因，高丰度的分子退火快。而 且，留下的差异表达的ss cDNAs（为第二次杂交所需）明显富集，因为tester和driver cDNA非目标 cDNA形成杂合体。重要事项：开始杂交前，一定要使 4 杂交缓冲液已到室温至少 15-20min 。在使用缓冲液前，1、对于每一实验和骨骼肌消减杂交，在一 0.5ml 离心管中按下表混合试剂表 2 、配制第一次杂交反应( 重复每一实验 tester cDNA 和对照骨骼肌 cDNA)杂交标本 1( l) 杂交标

29、本 2( l)Tester1-1( l) Tester1-2( l)Rsa1-消化的 driver cDNA( 来源于E2.1)1.51.5 Adaptor-1连接的 Tester1-1(来源于 F.8)1.5- Adaptor-2连接的 Tester1-2 ( 来源于 F.8)-1.54 杂交液1.01.0总体积4.04.02、 覆盖石蜡油并短暂离心3、在PCF仪中，98C， 1.5min4、68 C杂交8小时，立即进入 Section H*标本可以杂交短至 6小时，长至 12小时，但勿超过 12小时H、第二次杂交两份来自于第一次杂交的标本混合在一起，且新变性的 driver cDNA 也可

30、以进一步富集差异表达 的序列。末端具有不同adaptor的代表不同表达的cDNA新杂合体分子就形成了。注意：不要在此阶段变性第一次杂交的标本，也不要将杂交标本置于PCF仪外超过加入新的driver 所需时间。对于每一实验tester cDNA和对照骨骼肌cDNA重复下列步骤：1 、 在一消毒管中加入下列试剂：driver cDNA(Section E)1l4 杂交缓冲液1l消毒 dH2O2l2、取 1 l 上述混合物于 0.5ml 离心管并覆盖 1 滴矿物油3、在 PCF仪中，98C, 1.5min4、从PCR仪中取出新变性的driver，采用下列步骤同时混合driver和杂交标本1和杂交标本

31、 2(Section G 中制备，见表 2)。这保证两杂交样本仅在存在 driver 的情况下才混合在一起。A、将加样枪调到 15 lB、将枪尖轻轻接触含杂交标本 2 的离心管的矿物油 /标本界面C、仔细抽吸整个样品的一半入吸尖。如果伴有少量石蜡油不用担心。D、从管中移出吸尖，吸入一小部分空气，在标本下方造成一空气分隔。E、在含新变性的driver管中重复步骤B-D。这时，吸尖中含被空气分隔的两种标本F、将整个混合物转移到含杂交标本 1 的管中。G、上下吹打混匀。5、如有必要，短暂离心6、68 C过夜7、加入 200 l 稀释缓冲液，吹打混匀8、PCR仪中75C加热7min。9、-20 C储存

32、I 、PCR 扩增差异表达的cDNA在这一节所描述的反应中得到选择性扩增。在热循环之前，需要75C短暂预孵育以填平adaptor丢失的链（步骤7），这是为了创造PCR引物1的结合位点。在第一次扩增时，仅末 端具有不同adaptor序列的ds cDNA呈指数扩增。在第二次，巢氏PCR被用来进一步降低背景和富集 差异表达的序列。推荐的最小实验为5个反应：消减的实验cDNA非消减的tester control （1-c）; 消减的对照骨骼肌 cDNA非消减的tester control （2-c）:PCR Control消减cDNA （kit内提供）。PCRControl消减cDNA提供一个阳性PC

33、F对照和含一成功的Hae3-消化X174 DNA消减混合 物。推荐再作一标准 PCR对照（如Advantage cDNA PCR kit中提供的对照模板）以验证酶有效工作与 否。在第一次杂交步骤时，有 ss tester 分子均衡化发生。因此，在第二次杂交时，形成了一非常低 浓度的具有不同adaptor的cDNA分子（见简介，图2）。因而，仅有1000-10000个这种目标分子存在 于1 l稀释的消减cDNA中，且在PCR后，在消减的cDNA中，差异表达的cDNA可能未被很好的 represented。为了增加该消减文库的代表性，建议进行几次相同的独立的第一次PCR扩增，然后在第二次PCR前混

34、合。注意：所有的循环参数均已经 Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480 和 Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400/9600优化。如果使用不同的PCF仪，循环参数必须优化。如果不使用Advantage KlenTaq Polymerase Mix ，可以使用Taq DNA多聚酶。但是，在第一和第 二次PCF中,需要增加3-5个循环，而且也必须使用热启动（更多的信息，请参阅简介，Section IV.A）。 Clontech s TaqStart Antibody（#5400 -1,-2 ； Advantage Mix 中有）工作

35、得很好。可以按下完成热启 动：准备没有Taq酶的第一次PCR Master Mix ;混合PCR标本并加热反应混合物至 75C min ； 迅速加入所需的Taq酶；75C孵育5min；按步骤8完成PCR1、准备PCR模板a、取1 l每一稀释的cDNA每一从步骤IV.H.8和来源于步骤IV.F.10相应未消减的对照）加入一合适的标记管b、取11 PCR Control消减cDNA试式剂盒提供）加入一合适的标记管2、准备所有第一次试剂。PCR加一额外管的Master Mix。对于每一计划的反应，按表 3的顺序混合表 3、准备第一次 PCR Master Mix试剂每一反应量（ l ）7 次实验量（

36、 l ） *消毒 dH2O19.5156.010 PCR反应缓冲液2.520.0dNTP Mix (10mM)0.54.0PCF引物 1(10 M)1.08.050 Advantage KlenTaq Polymerase Mix0.54.024.0192.0*对于每一额外实验cDNA准备一额外Master Mix3、旋振混匀，短暂离心4、取 24 l Master Mix 加入步骤 1 准备的试管。5、50 l 石蜡油覆盖。6 在PCR仪中75C, 5min以延伸adaptor（不要将样品移出PCF仪）。注：这一步是填平adaptor的缺失链（参阅简介中的图2）并形成PCF引物的结合位点7

37、立即进行PCF循环Perkin-Elmer DNA Thermal Cycle 48027 循环94C, 30sec66 C, 30sec72C， 1.5minPerkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400 或 960094C, 25sec27 循环94 C, 10sec66 C, 30sec72C, 1.5min9、在1 TAE缓冲液中，以2.0%琼脂糖凝胶分析8 l产物（预期结果见Section V .D）10、对每一 PCF反应，以27 l dH 2O稀释第一次PCR产物11、从步骤10稀释的第一次PCF产物混合物中取1 l加入一合适的管中注：如果有几管独立的P

38、CR反应，在此混合12、按表4准备第二次PCF加一额外管的混合试剂表 4、准备第二次 PCR Master Mix试剂2.58.0每反应量( l )5 次实验量( l ) 消毒 H2O18.5148.010PCF反 应缓冲液20.0巢氏 PCF引物 1(10 M)1.0巢氏 PCF引物 2(10 M)1.08.0 dNTP合物 (10mM)0.54.0 50 Advantage KlenTaqPolymerase Mi 0.54.0总体积24.0192.0 13 、 旋振混匀并短暂离心14、 从步骤 11 取 24 l Master Mix 加入每一反应管16、 以一滴石蜡油覆盖17、立即进行

39、 PCF反应：Perkin-ElmerDNASystemPerkin-Elmer GeneAmp PCF Thermal Cycler 4802400 or 960010-12 cycles94C , 30sec68C , 30sec1.5min10-12 cycles94C , 10sec68C , 30sec72C , 1.5min72C ,18、在1 TAE缓冲液中每管取8 l行2.0%琼脂糖凝胶电泳分析19、反应产物储存于 -20CPCR产物中应富集差异表达cDNA另外，在原始mRN中丰度不同的差异表达转录物粗略趋向 于相同的比例。参阅Section V.D和V.E的结果分析一图6显示

40、的是用从骨骼肌polyA RNA来的 cDNA所作的成功了的对照消减杂交。图 7和8显示的是单纯的消减效率检测。可以用T/A载体克隆产物（见Section VI.C）或使用RsaI位点，用合适的载体完成平末端连 接而形成消减文库。消减混合物也是筛选基因组DNA全长cDNA文库、YAC BAC或粘粒克隆的理想探针。当完成了消减cDNA文库后，可用Northern杂交分析证实个体克隆的表达特征。在我们的经 验，消减文库中与差异表达 mRN相对应的克隆的百分数变化非常大，高的达95%中等的40-60%, 低的 5%。推荐随机挑选 10-20 个克隆作为 Northern 杂交的探针。如果少于 2个克

41、隆被证实为差 异表达基因，应当完成差别筛选过程 （Section VI.C） 以排除假阳性。如果缺乏完成标准的Northern杂交的足够的polyA RNA，可以创造虚拟的Northern杂交以产生类似的信息。要进行虚拟 Northern blot ，使用CapFinder PCR cDNA合成试剂盒倂k1052-1) 以从总的或polyA RNA样品产生CapFinder cDNA。然后在琼脂糖凝胶上电泳 CapFinder cDNA,原 位变性，转移到尼龙膜。有关 CapFinder cDNA合成技术和虚拟Northern blot的更多信息，请参 阅 1996 年 10 月的 CLONT

42、ECHniquesV、结果分析和疑难解答A、析ds cDNA合成产物 1 、 一般推荐a、为了监测cDNA合成的进展和产量，用实验样品和对照骨骼肌polyA RNA完成cDNA第一链和第二链的合成。推荐在第一链合成反应混合物中加入-32PdCTP以监测cDNA合成和纯化。b、使用高质量polyA RNA ds cDNA的产量依赖于RNA的质量。从骨骼肌来的对照polyARNA典型产生2 g ds cDNA。从高质量实验 polyA RNA来的ds cDNA产量类似(1-2 g)。 用如图4所示的琼脂糖凝胶分析cDNA合成和RsaI消化的效率。2、ds cDNA 合成的疑难解答a、 如果琼脂糖凝

43、胶分析显示实验 但大小分布相似，仍可以使用实验 替代的方法是可以使用更高浓度的ds cDNA产量较从骨骼肌polyA RNA来的ds cDNAf氐, cDNA但是，可能已丢失了低丰度的差异表达序列。polyA RNA重复第一链cDNA合成。b、如果实验ds cDNA琼脂糖凝胶电泳呈现为1-2kb的片状物，RNA可能不纯或已经降解了。在福尔马林变性琼脂糖凝胶使用开始材料检测RNA完整的腐乳类动物polyA RNA应该是一片状物(通常0.5-9kb)，分别在4.5和1.9kb处伴有清晰的28s和18s RNA带。 对非腐乳类物种，polyA RNA的分布可能较小(0.5-3kb)。如果实验poly

44、A RNA显得较 期望的小(如不大于1-2kb)，或者在起始总RNA中 28s对18s RNA虽度比小于1: 1，检 测RNA纯化试剂是否含有RNase或其它杂质，而且，有必要的话，使用新的试剂制备 RNA如果问题依然存在，也许需要找另外的polyA RNA源，例女口 CLONTECHs PolyA RNAsc、第一链cDNA合成的polyA RNA优化浓度为50-200 g/ml。如果使用低浓度 RNA合成的cDNA产物大小分布可能减低。B、分析RsaI消化 取2.5 l未消化的ds cDNA和5 l RsaI消化的cDNA于 1 TAE缓冲液中，在1%琼脂糖上电泳，比较结果。从 polyA

45、 RNA来的ds cDNA显示为0.5-10kb的片状 物。亮的带与丰富的 mRNA或rRNAs相对应。对某些非哺乳类来源的 RNA勺大小分布可能 仅0.5-3kb oRsaI消化后，平均cDNA大小较小(0.1-2kb 对0.5-10kb)。如果样品或对照cDNA 大小在 RsaI 消化后并未减小的话，重复酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀和消化。可选项目。为了鉴定样品是否完全消化，取 1小部分1小时和1小时20分钟的DNA样品 并在琼脂糖凝胶上比较。如果两份样本的 DNA大小分布相似，消化完全。C、分析连接推荐完成下列PCR实验以证明至少25%的DNA在其双末端具有adaptor。本实验是设计来用以

46、扩 增跨越Tester1-1和Tester1-2 的adaptor/cDNA连接的片段(见Section IV.F)。对照实验中的 G3PDH 引物适用于人、小鼠和大鼠。对其它物种，需要设计合适的引物。注：推荐作一标准PCM照（如Advatage cDNA PCR试剂盒的阳性对照模板）以证实酶是有效的1. 将 11 来自于 Section IV.F 的连接 DNA如 Tester1-1 和 1-2）以 200 l dH 2O稀释。2. 在4只试管中按表V混合试剂表 5、配制连接反应分析试剂 （ 单位： l）（对每一实验tester cDNA和对照骨骼肌cDNA进行重复）成份试管 12341 1

47、 - -Tester1-1( 连接 adaptor1)Tester1-2( 连接 adaptor2)-11G3PDH3引物(10 M)1111G3PDH5引物(10 M)-1-1PCR引物 1(10 M)1-1-总体积33333. 准备所有反应管加一额外管的 Master Mix 。对于每一计划的反应，按表 VI 顺序混合试剂表 VI 准备连接分析 PCR Master Mix试剂每反应量 （ l）4 次反应量 （ l）消毒 dH2O18.592.510 PCR反应缓冲液2.512.5dNTP Mix(10mM)0.52.550 Advantage KlenTaq Polymerase Mix

48、0.52.5总体积22.0110.04、旋振混匀并短暂离心5、取 22 l Master Mix 加入到步骤 2 的反应管。6、旋振混匀并短暂离心7、覆盖 50 l 石蜡油8、在PCF仪中75C孵育5分钟反应混合物以延伸adaptor（不要将样品移出PCF仪） 注：该步补平adaptor丢失的链（见简介图2）以创造PCF引物的结点9.立即进行PCF循环Perkin-Elmer DNAPerkin-Elmer GeneAmp PCRThermal Cycler 480System 2400 or 960020 cycles94C, 30sec94C , 30sec20 cycles65C , 3

49、0sec94C , 10sec68C , 2.5min65C , 30sec68C, 2.5min10、 以 25 琼脂糖凝胶电泳检查产物典型结果见图 5。如果在 20轮循环后不能看见产物,增加 5个循环,再次凝胶分析产 物。循环数取决于cDNA中G3PDH勺量。在骨骼肌，G3PD非常丰富，可以看到使用一个基 因特异性引物（G3PDH 3引物）和PCR引物1的PCR产物应同使用两个基因特异性引物 （G3PDH 3和5引物）扩增的PCR产物有相似的强度，如图5。如果这些PCF产物的相应 片段相差 4倍以上，则连接效率低于 25%。这将明显降低消减效率，需重复连接反应。如果使用小鼠或大鼠cDNA使

50、用G3PDH 3引物和PCR引物1扩增的PCR产物将是大 小1.2kb而不是人的0.75kb带（因为大鼠和小鼠G3PDH cDN两引物间缺失RsaI限制性内 切酶位点）。但是，如果你使用人cDNA含 RsaI位点），而观察到了 1.2kb带和预期大小的 带，提示cDNA未被完全消化。如果有明显的未消化产物，重复 RsaI消化。切、额外实验A、减效率的PCF分析无论是PCR本节）或杂交分析（Section W .B）均可用来估计消减效率。这两种方法均是通过比 较消减前后已知cDNA丰度而实现的。理想的是既比较已知的未差异表达的基因（如管家基因），也比较已知的差异表达基因。PCF方法较杂交分析快。

51、下面描述的方法是使用试剂盒提供的 G3PDHH物以证实PCR-Select过程后相对减低的G3PDH 的丰度。注意这些G3PD仅可用于人、小鼠及大鼠。并非所有管家基因平衡消减。虽然在大多数组织和细胞，G3PDHIE常有效地消减，但也有例外， 包括骨骼肌和心脏。由于这个原因，不推荐使用G3PDH度以分析骨骼肌对照的消减效率。从骨骼肌来源的其它大多数管家基因被非常有效地消减，因而可以使用。一般来说，如果G3PDH丰度在消减后没有明显下降， 应该检查其它管家基因的丰度 （如 -tubulin） 。但是，在对照骨骼肌消减 实验，X174/Haem消化的琼脂糖凝胶条带形式（图6, 2列）已经显示消减是否

52、成功。1、将消减的和非消减的（非消减Terster Control 1-c）第二次PCR产物用dHO稀释10倍。2、按下表顺序在 0.5ml 离心管中混合下列试剂 （单位： l）稀释的消减cDNA（2次PCF产物)1.0 -稀释的非消减 tester control 1-c - 1.0总体积(2次PCR产物)G3PDH 3引物 (10M)1.21.2G3PDH 5引物 (10M)1.21.2消毒 dH2O22.422.410 PCR反应缓冲液3.03.0dNTP Mix(10mM)0.6150 Advantage KlenTaq Polymerase Mix0.6 0.630.0 30.03、

53、旋振混匀并短暂离心4、以一滴石蜡油覆盖5、使用下列循环参数作 18 个循环94C, 30 秒60C, 30 秒68C, 2分钟6、从每一反应取5 l放入一清洁管，其它的再放入 PCF仪行5个循环7、重复步骤 6两次（即在 28、 33循环后取 5 l）8、在2.0%琼脂糖凝胶上检查 5 l 样品（即18、 23、 28和33循环后的取出部分 ）图7显示的是消减成功的混合物中 G3PDH减少的例子。对于一非消减 cDNA可在18-23 循环间看到G3PDH产物，这取决于特异cDNA中 G3PDH勺丰度。（例如，在骨骼肌和心脏polyA RNA G3PD异常丰富）。但是，在消减样品，可在 5-15

54、个循环后才见。作为差异表达基因富集的阳性对照，使用已知仅在 tester RNA 中，但不在 driver RNA 中表达的已知基因的PCF引物重复上述过程。该cDNA在消减后应富集。从消减的和非消减的 样品中等量扩增相应PCRT物所需的循环次数的差别反映了消减的效率。5个循环粗略相当于 20倍cDNA浓度差别。由于发生于消减中的均衡化，富集的水平取决于每一差异表达基因的起 始丰度及在tester和driver中的丰度差。Tester cDNA中低丰度的差异表达基因较高丰度的 差异表达基因富集得更多。、，、-、八注意：不要用在扩增cDNA片段两引物间含有Rsal酶切位点的PCF引物。某些序列可能不能被杂交或扩增，而来源于同样cDNA勺其它cDNA片段可能剧烈富集。杂 交分析可以提供更多有关似乎已丢失的 cDNA片段的信息。B、 消减效率勺杂交分析使用不同基因作为探针对消减的和非消减的（非消减 Tester control 1-c ）进行斑点与Southern杂交分析可以帮助确定消减是否成功。如图8所示，消减后管家基因cDNA丰度应降低,而已知上调基因cDNA应