E花环形成试验

1、实验二E花环形成试验实验者：学号：同组者:一.实验目的1掌握T淋巴细胞E花环试验的原理、正常值，了解其方法和用途。 2熟悉光镜下E花环的形态和计数方法。二.实验原理人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（SRBC的受体，可与SRBC结合形成花环样细胞团（即E花环）。由于T细胞的异质性，其中在 4 C放置1h以上，所形成的花环数代表 T 细胞总数，称为总花环（Et花环），而T细胞与SRBC昆合后不经4C作用立即反应形成的花 环数称为活性花环（Ea花环）。实验用品1实验试剂：肝素抗凝静脉血、Hanks液（实验中以过期1640培养基代替）、PBS缓冲液、淋巴细胞分离液、绵羊红细胞悬液、0.8%戊二醛、

2、瑞氏染液。2. 实验器材：吸管、玻片、试管、离心机、显微镜。四. 实验过程1. 淋巴细胞悬液的制备取肝素抗凝血2ml，加入2ml Hanks液稀释液后叠加于 2ml分离液上，离心2000r/min ,20min ;用毛细吸管吸出位于血浆和分离液之间的乳白色单个核细胞层（如图1所示）,加入5ml Hanks 液洗 2 次（1500r/min , 10min）,弃上清液，用 Hanks 液配制成 1-2 x 10/ml 细胞。图1淋巴细胞分离示意图2. 绵羊红细胞悬液的配制将保存于Alsever s液中的绵羊红细胞，用5-10倍量生理盐水洗 3次（1500r/min ,离心10min ）弃上清液，

3、用生理盐水配制成0.5%的SRBG1液（108个细胞/ml ）。3. Et花环试验（1）取2ml 0.5%SRBG悬液和1ml含淋巴细胞的 PBS加入离心管中，混匀，置 37 C水浴5min（2）取出离心 500r/min 5min, 置4C 1-2h或过夜。 沿管壁加入0.8%戊二醛2ml,置4 C 20min。（4）弃适量上清，约留 2ml,轻轻吹吸混匀沉淀细胞。（5）结果观察 湿片法观察：取1d细胞悬液滴加于载玻片上，加少许吉姆萨-瑞氏染液染色，加盖玻片后高倍镜下观察；干片法观察：取细胞悬液涂片，自然干燥，用吉姆萨-瑞氏染液染10min，水洗，干燥，高倍镜或油镜下观察。4. Ea花环试验

4、与Et花环试验基本相同， 不同之处是SRBC悬液的浓度为0.1%, SRBC与T细胞混合之比为10:120:1 ,混合后立即离心 500r/min 5min ，加入0.8%戊二醛固定。判定结果：淋巴细胞呈蓝紫色或淡蓝色，SRBC不着色，凡结合 3个SRBC或以上者为E花环形成细胞（ERFC。要求： 计数200个淋巴细胞，求出 E花环形成率（%形成花环细胞数E花环形成率（% =形成花环细胞数未形成花环细胞数 X 100%五. 实验结果如图2所示为活性花环（Ea花环）图240 X镜下活性花环（Ea花环）图如图3所示为总花环（Et花环）图340 X镜下总花环（Et花环）图六. 分析讨论1. 经查相关

5、资料，E花环试验常用作人外周 T细胞的分离与鉴定，一般认为ERFC的正常值在60%以上，如少于50 %则为低下，而活性 E花环（Ea花环）可能代表T细胞的一个 亚群，正常值仅为总 E花环的1/31/2，约20%40%。如欲分离 T细胞，可用密度梯度 离心，ERFC因比重增大而沉于管底，与其他细胞分离；用低渗法裂解花结中的SRBC，即可获得纯化的T细胞。2. 本次实验所得花环数较少，后未要求进行统计计数，但初步估计E花环形成率约20%30%且Et花环与Ea花环相差不大，可能的原因有：.影响E花环实验最主要的因素淋巴 细胞和红细胞的新鲜程度，被检血样必须新鲜，无菌，采血后要求在3h4h内进行检验，

6、否则由于淋巴细胞的死亡，受体脱落，影响检查结果。红细胞用阿氏液保存最多不要超过3周，且不应溶血，所以可能是血样活力不足，T淋巴细胞与绵羊红细胞比例稍低造成花环较少。.通常Hanks液的pH以7.27.4为宜，实验中以过期 1640培养基代替，有可能影 响结合的稳定性。未控制好反应温度、 时间等条件，一般37C作用10min，低速离心5min , 置4C 2h4h,其结果稳定性较好，结合率较高。本次实验4C保存1小时，可能反应不充分。可能是计数前吹吸混匀时力度过大，造成花环解离。3. 本次实验戊二醛固定是通过绵羊红细胞与T细胞表面的氨基交联固定（关于试剂中的醛基是否参与形成醛亚胺键，目前还有争论。但是普遍认为，戊二醛的作用可能是戊二醛水溶液中存在的a、不饱和齐聚物的乙烯键与自由的氨基结合），使花环结合部位稳定。氨基与戊二醛之间的交联是不可逆的，所以先固定后吹吸混匀再染色计数，可减少机械力分开结合花环。4. 其他注意事项：.SRBC与