蛋白质类药物的分离纯

1、四.生物药物的制备 3.蛋白质类药物的分离纯化方法,生产过程,上游构建 （基因工程,发酵生产 (发酵工程,纯化制备,来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； 分离和纯化过程都必须在温和条件下进行,蛋白质的分离纯化,产物特性 作用,等电点 决定离子交换种类及条件 相对分子量 选择不同孔径的介质 疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 生物特异性 决定亲和配基 溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 稳定性 决定工艺采用温度及流程时间,1）蛋白质的基本特性,蛋白质分子中存在游离氨基和羧基，具有两性解离性质。 当蛋白质溶液处于某pH时，蛋白质分子解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶液pH称为蛋白质的等电

2、点pI,两性解离与等电点,利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质,蛋白质分子量很大，分子粒径为1100nm，属亲水胶体在水中能形成稳定胶体溶液。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定亲水溶胶的两个重要因素,蛋白质的胶体性质,蛋白质的沉淀,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所 带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来,蛋白质沉淀 蛋白质的肽链相互聚集，从溶液中析出,蛋白质胶体颗粒的沉淀,沉淀,疏水胶体,疏水胶体,沉淀过程中，蛋白质结构和性质都不发生变化， 在适当条件下，可以重新溶解形成

3、溶液。 是分离、纯化蛋白质的基本方法。如：等电点 沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。 去除变性因素后，恢复原有空间构象和生物活性,蛋白质的非变性沉淀,核糖核酸酶可逆变性,在强烈沉淀条件下，蛋白质胶体溶液的稳定性、蛋白质分子结构和性质均被破坏，沉淀不能重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以是变性沉淀。 加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀,蛋白质的变性沉淀,盐析 电泳 透析 层析 分子筛 超速离心,2）蛋白质的分离纯化方法,定 义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。 原 理：破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层。

4、 中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。 优 点：Pr不变性，常用,盐析（Salting out,定义：带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相 反方向泳动的现象叫电泳。 原理： Pr分子在溶液中可带净负电荷或净正电荷，可在电场中移动。 不同Pr分子携带电荷量不同，分子大小也 不同，故在电场中泳动速度不同，可彼此分离,电泳（electrophoresis,电场中，带净电荷Q的粒子所受电荷引力： 溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力F阻： 当F引=F阻时,粒子泳动速度V与场强E、粒子电量Q成正比； V与粒子半径r、溶液粘度成反比； V与粒子形状有关。 非球形分子（如线状DNA）在电泳过

5、程中受到更大的阻力,电泳过程示意图,A. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE,以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。 聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，有弹性，透明， 化学性质稳定，对pH和温度变化小，吸附和 电渗作用小，是很好的电泳支持介质。 丙烯酰胺单体 N，N-甲叉双丙烯酰胺交联剂,催化合成,丙烯酰胺,N, N-甲叉 双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,常规聚丙烯酰胺凝胶电泳主要特点,凝胶由上、下两层凝胶组成 上层大孔径浓缩胶，浓度23； 下层小孔径分离胶，浓度515； 缓冲液中主要阴离子Gly-, Cl-； 凝胶pH不同 电极缓冲液pH8.

6、3的Tris-甘氨酸缓冲液； 浓缩胶pH6.8的Tris-HCl缓冲液； 分离胶pH8.9 的Tris-HCl缓冲液； 三种物理效应样品浓缩效应，凝胶分子筛效应，电荷效应。 分离效果好，分辨率高,Tris-Gly pH=8.3,Tris-Gly pH=8.3,Tris-HCl pH=6.8 T=3,Tris-HCl pH=8.9 T=7.5,板状电泳,B. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳,当电泳体系含有十二烷基硫酸钠（SDS）时,电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，可直接由电泳迁移率计算蛋白质分子量,SDS的作用原理,阴离子SDS能与蛋白质结合。 当SDS总量为蛋白量的310倍、且SDS单

7、位浓度大于1mol./L时，两者的结合是定量的，每克蛋白质约结合1.4克SDS。 蛋白质分子结合SDS后，所带负电荷的量远远超过其原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷负荷的差异,蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。 不同蛋白质-SDS复合物形状相似（长椭球状）。 电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合 物的大小，即取决于蛋白质分子量的大小，而 与蛋白质原来所带电荷量无关,SDS的作用原理,测定蛋白质分子量,当蛋白质分子量为17,000165,000时，复合物电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=lgKbm MW 蛋白质分子量； m 相对迁移率； K 常数； b 斜

8、率,将已知分子量的标准蛋白质在SDS -聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。 测定未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，根据标准曲线求得其分子量,测定蛋白质分子量,SDS-PAGE separates proteins by MW,十二烷基硫酸钠,凝胶色谱,利用生物大分子的相对分子质量差异，进行层析/色谱分离的方法。 凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。 凝胶层析介质是惰性球状凝胶颗粒，内部为多孔网状结构，形成很多孔穴,凝胶层析原理,

9、凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来,凝胶色谱分离,凝胶色谱分离的应用,生物大分子物质的分离纯化 分子量的测定 分级分离 溶液浓缩 平衡常数的测定 细胞及颗粒的分离,分子量的测定,蛋白质通过凝胶柱的速度，即洗脱体积与其分子量有关,LogM=k1-k2Ve,Ve为洗脱体积,先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量,定义: 利用离子

10、交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的Pr进行分离的方法。 分类:阳离子交换树脂,如羧甲基纤维素等， 阴离子交换树脂,如二乙基氨基乙基纤维素,离子交换色谱,原理:带正电荷多的Pr与树脂结合较强，而带正电荷少的Pr与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的Pr进行分离,带正电荷多蛋白紧密结合,带负电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,离 子 交 换 色 谱,柱 层 析,亲和层析法,琼脂糖凝胶,连接臂,蛋白质分子,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,亲 和 色 谱,亲和层析的特点,纯化效率极高：亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，提纯度可达几千倍,透析法（Dialysis,定义：利用半透膜把大小分子分